用于亚细胞定位的三种植物原生质体分离体系的建立与优化

摘要

植物原生质体是除去细胞壁由质膜包被的裸露细胞。与完整的植物细胞相比，植物原生质体较为脆弱，但其一样含有完整遗传物质，具有全能型，具有再生新植株的潜能。原生质体可以高效摄取外界DNA、细胞器、病毒等物质，还可与与其不亲和植株的原生质体相互融合进而分化产生新植株。植物原生质体在生物基础理论研究、作物品种改良、基因瞬时表达及蛋白的亚细胞定位等研究中具有十分重要的意义。
　　植物细胞壁的主要成分为纤维素、半纤维素和果胶。本研究以课题组内研究较为广泛且较具研究前景的三种植物:鹰嘴豆、大豆的幼嫩真叶及梭梭的幼嫩同化枝为材料，研究了不同酶解液组合、不同酶解液中甘露醇浓度、不同顸处理时间、不同酶解液pH以及不同酶解时间对三种植物材料原生质体分离的影响，旨在分离数量较大且具有较高活力的原生质体，以为后期原生质体培养、融合、基因的瞬时表达及蛋白的亚细胞定位等研究提供技术支持。具体结果如下:
　　1.建立了kabuli型鹰嘴豆原生质体快速分离体系。以10-30 d苗龄的鹰嘴豆幼嫩叶片作为游离材料，其最佳原生质体分离条件为于CPW-M13溶液中质壁分离处理3h后转入酶解液中，黑暗条件下，27℃恒温水浴振荡器上45 rpm震荡酶解7-8 h。其最佳酶解液组合成分为0.5％纤维素酶Onozuka R-10+0.8％半纤维素酶Hemicellulase+0.8％离析酶Macerozyme R-10+0.1％ MES+10％甘露醇溶于CPW溶液中，pH为4.8。
　　2.建立了大豆品种湘豆3号原生质体快速分离体系。以10-30 d苗龄的湘豆3号的幼嫩真叶作为游离材料，其最佳原生质体分离条件为于CPW-M13溶液中质壁分离处理2h后转入酶解液中，黑暗条件下，27℃恒温水浴振荡器上45 rpm震荡酶解6h。其最佳酶解液组合成分为0.5％纤维素酶Onozuka R-10+0.8％半纤维素酶Hemicellulase+0.8％离析酶Macerozyme R-10+0.4％果胶酶Pectolyase Y-23+0.1％MES+10％甘露醇溶于CPW溶液中，pH为6.0。
　　3.建立了梭梭原生质体快速分离体系。以长度达到2-3 cm梭梭的幼嫩同化枝作为原生质体游离材料，其原生质体分离最佳酶解液组合成分为1.0％纤维素酶Onozuka R-10+0.4％离析酶Macerozyme R-10+0.1％ MES+10％甘露醇溶于CPW溶液中，pH为5.6，黑暗条件下，27℃恒温水浴振荡器上45 rpm震荡酶解10-11 h。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 植物原生质体概述

1．1 原生质体概况

1．2 植物原生质体分离的研究概况

1．3 植物原生质体的制备、纯化及活力检测

2 鹰嘴豆概述

2．1 鹰嘴豆介绍

2．2 鹰嘴豆研究概况

3 大豆概述

3．1 大豆介绍

3．2 大豆研究概况

4 梭梭概述

4．1 梭梭介绍

4．2 梭梭研究概况

5 本课题研究的目的、意义及相关研究内容

第二章 鹰嘴豆叶片原生质体分离体系的建立与优化及其在亚细胞定位中的应用

1 前言

2 材料、设备与试验方法

2．1 试验材料

2．2 主要试剂和仪器

2．3 试验方法

3 结果与分析

3．1 不同酶种类及其配比对Kabuli型鹰嘴豆叶片原生质体分离的影响

3．2 不同甘露醇浓度对Kabuli型鹰嘴豆叶片原生质体分离的影响

3．3 不同预处理时间对Kabuli型鹰嘴豆叶片原生质体分离的影响

3．4 不同酶解液pH对Kabuli型鹰嘴豆叶片原生质体分离的影响

3．5 不同酶解时间对Kabuli型鹰嘴豆叶片原生质体产量与活力的影响

3．6 鹰嘴豆叶片原生质体在亚细胞定位中的应用

4 讨论

第三章 大豆叶片原生质体分离体系的建立与优化及其在亚细胞定位中的应用

1 前言

2 材料、设备与试验方法

2．1 试验材料

2．2 仪器设备

2．3 试验方法

3 结果分析

3．1 不同酶的种类及配比对湘豆3号叶片原生质体分离的影响

3．2 不同甘露醇浓度对湘豆3号叶片原生质体分离的影响

3．3 不同预处理时间对湘豆3号叶片原生质体分离的影响

3．4 不同酶解液pH对湘豆3号叶片原生质体分离的影响

3．5 不同酶解时间对湘豆3号叶片原生质体分离的影响

3．6 湘豆3号叶片原生质体在亚细胞定位中的应用

4．讨论

第四章 梭梭同化枝原生质体分离体系的建立与优化

1 前言

2 材料、设备与试验方法

2．1 试验材料

2．2 主要试剂和仪器

2．3 试验方法

3 结果分析

3．1 不同酶的种类及配比对梭梭幼嫩同化枝原生质体分离的影响

3．2 不同甘露醇浓度对梭梭同化枝原生质体分离的影响

3．3 不同预处理时间对梭梭同化枝原生质体分离的影响

3．4 不同酶解液pH对梭梭同化枝原生质体分离的影响

3．5 不同酶解时间对梭梭同化枝原生质体分离的影响

4．讨论

全文总结

本论文的创新点

参考文献

附录

在读期间发表论文

致谢