丙戊酸对牛胎儿成纤维细胞生长、牛卵母细胞成熟及早期胚胎发育的影响

摘要

自从1997年体细胞克隆羊“多莉”诞生以来，人们利用体细胞核移植的方法产生了多种动物。这一技术在生物学基础研究及医学中具有重要意义，但因为克隆胚胎发育率低、胎盘发育异常、胎儿流产率高以及出生后异常等原因的限制，使得这项技术不能广泛应用。有研究证实，供体细胞核在受体卵母细胞中不完全或异常的表观遗传重编程是导致克隆胚胎发育异常的重要原因之一。丙戊酸(ValproicAcid，VPA)作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，能特异性抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，提高细胞内组蛋白乙酰化水平，激活基因的表达。但VPA对体细胞生长、卵母细胞成熟以及胚胎发育的作用机制还不清楚。
　　 本实验首先探讨了VPA处理牛胎儿成纤维细胞后对细胞生长及细胞周期的影响，比较了处理前后细胞内基因表达的差异，研究了VPA对能够作为核移植供体细胞的成纤维细胞表观遗传的影响。同时，实验以牛卵母细胞及体外发育胚胎为研究对象，探讨VPA处理对牛卵母细胞成熟、体外受精及孤雌胚胎发育的影响，旨在为辅助生殖技术以及克隆效率的提高提供依据。
　　 1、丙戊酸对体外培养牛胎儿成纤维细胞的影响
　　 本实验用不同浓度的VPA处理牛胎儿成纤维细胞，研究其对细胞生长的影响，同时利用荧光流式分选技术分析了VPA处理对细胞周期的影响，接下来通过Real-timePCR检测了VPA处理前后转录因子Oct4、Nanog和Cdx2基因的表达变化。结果显示，随着VPA浓度的增加，牛胎儿成纤维细胞的生长逐渐减慢，G0/G1期细胞数逐渐增多。检测转录因子Oct4、Nanog和Cdx2基因的表达发现，与未处理组相比VPA处理后细胞Oct4、Nanog的表达量升高，而Cdx2基因的表达量降低。本研究提示，用VPA处理过的牛胎儿成纤维细胞作为体细胞核移植的供体细胞，利于克隆胚胎表观重编程及发育。
　　 2、丙戊酸处理牛卵母细胞、体外受精卵及孤雌激活胚胎对其发育的影响
　　 本实验首先在卵母细胞成熟过程中添加不同浓度的VPA，分析其对卵母细胞成熟，及对体外受精和孤雌激活胚胎发育的影响；其次检测不同浓度的VPA对胚胎发育及囊胚期Oct4、Nanog和Cdx2基因表达的影响。结果显示，卵母细胞体外成熟过程中添加VPA后，0.03mM和0.3mM组的成熟率与对照组无显著差异，3mM和6mM组成熟率极显著地低于对照组(p<0.001)；其中0.3mM和3mM组的卵母细胞经体外受精和孤雌激活后，囊胚发育率均显著地低于对照组(p<0.001)；0.3mMVPA的添加对体外受精胚和孤雌激活胚的卵裂率和囊胚率均无显著影响，但显著提高了囊胚期Oct4、Nanog和Cdx2的表达量(p<0.05)；而添加3mMVPA则极显著地降低外受精胚和孤雌激活胚的卵裂率和囊胚率(p<0.001)。研究结果表明，在体外受精胚和孤雌胚的体外培养过程中添加小剂量VPA(0.3mM)虽不提高囊胚发育率，但显著影响了一些发育相关基因的表达，可能有助于囊胚质量的提高及改善植入后胚胎的发育。