山羊、牛MyoG启动子序列克隆及其活性分析

摘要

肌细胞生成素(myogenin，MyoG)是生肌调节因子(MRFs)基因家族中唯一能在骨骼肌细胞发育与生长过程中均可表达的调控因子，在肌肉细胞分化过程中起着中心调控的作用，它正调控着骨骼肌卫星细胞向成熟肌细胞分化的过程，是唯一不可代替的生肌调节因子。MyoG基因在复制、扩增、基因激活、转录、翻译等多级水平上对肌肉发育进行调控。基因转录的起始阶段是机体生长发育因子进行调控的开端，而此阶段调控的实质是通过启动子和上游调控序列的相互作用，调控目的基因的表达。因此克隆MyoG基因的启动子，探讨启动子区域的启动活性，有助于从理论上揭示MyoG基因表达的关键调控位点，同时也有利于揭示肌肉发育调控的相关机理，为治疗人类相关疾病以及改良家畜肉质研究提供实验依据。
　　本研究分别克隆了山羊和牛的MyoG启动子序列，并构建了真核表达载体pDsRed-GoatMyoG和pDsRed-BosMyoG，通过脂质体介导法将表达载体转染不同种类细胞，然后采用实时荧光定量PCR技术、WesternBlot技术和免疫组化技术检测MyoG启动子在不同体外培养细胞中启动外源基因的特异性和启动效率。同时，将表达质粒注射到雄鼠股骨内侧肌肉内，检测启动子在活体组织内的表达特异性和启动效率。
　　1.MyoG启动子的克隆和肌肉特异表达载体的构建
　　分别克隆出山羊和牛MyoG基因的启动子序列，与NCBI-BLAST已报道序列进行比对，同源性为100％;两种MyoG启动子分别连入pDsRed2-1骨架构建了以红荧光蛋白基因为标记基因的真核表达载体pDsRed-GoatMyoG和pDsRed-BosMyoG，经酶切和测序鉴定，证实载体构建成功。
　　2.MyoG启动子组织特异性及启动效率检测
　　表达载体pDsRed-GoatMyoG、pDsRed-BosMyoG分别转染体外培养的绵羊肌卫星细胞、肌管细胞和成纤维细胞，观察红色荧光蛋白表达情况，然后利用实时荧光定量PCR和WesternBlot技术检测细胞转染后标记基因mRNA和蛋白水平的表达效率。结果表明，转染质粒pDsRed-GoatMyoG、pDsRed-BosMyoG后，肌卫星细胞和肌管细胞在显微镜下均可观察到细胞发红色荧光，成纤维细胞没有红色荧光。通过实时荧光定量PCR检测得出，转基因肌管细胞内GoatMyoG启动DsRed基因表达mRNA的相对量为14.07，BosMyoG启动DsRed基因mRNA相对量为9.02，GoatMyoG启动外源基因的效率是BosMyoG的1.55倍;通过WesternBlot技术检测得出转基因肌管细胞内GoatMyoG启动DsRed蛋白的量明显高于BosMyoG启动DsRed蛋白的量，在成纤维细胞内没有检测到DsRed蛋白质。说明GoatMyoG启动子在肌卫星细胞和肌管细胞内启动外源基因的效率高于BosMyoG启动子的启动效率，且均可在肌肉组织特异性启动外源基因表达。
　　选择启动效率相对较高的GoatMyoG启动子所构建的表达载体对小鼠进行肌肉注射，检测GoatMyoG启动子在体内组织中的启动特异性和效率。肌肉注射五天后，分别取小鼠的注射腿肌肉组织、非注射腿肌肉组织、睾丸组织、肠组织和肝脏组织，通过实时荧光定量PCR检测标记基因DsRed在不同组织中的表达情况。结果表明，注射腿肌肉组织内GoatMyoG启动DsRed基因转录mRNA的相对量为212.32，非注射腿肌肉组织内mRNA的相对量为39.76，注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内mRNA的量均是其它组织的1.99倍以上。通过免疫组化技术在注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内均可检测到红色荧光蛋白，在睾丸、肠和肝脏内均未检测到DsRed蛋白。结果表明，MyoG启动子在体内肌肉组织中可以特异性启动DsRed基因表达。
　　实验结果表明MyoG启动子可以特异性的在骨骼肌组织驱动外源基因的表达，是一种有效的肌肉特异性启动子，且山羊MyoG启动子的启动效率高于牛MyoG启动子。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 实验研究

第一章 MyoG启动子序列克隆及肌肉特异表达载体的构建

第一节 山羊MyoG启动子克隆和表达载体的构建

第二节 牛MyoG启动子克隆和表达载体的构建

参考文献

第二章 MyoG启动子肌肉特异性活性检测

第一节 MyoG启动子在绵羊体外培养细胞中的活性检测

第二节 MyoG启动子在小鼠肌肉组织内启动活性检测

参考文献

结论

图版一

图版二

图版三

第二部分 文献综述 MyoG基因的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文