白酒发酵过程中原核微生物群落分析

摘要

本论文以浓香型白酒酒醅、大曲和窖泥中的原核微生物为研究对象，采用PCR-SSCP方法初步分析了白酒发酵过程中原核微生物群落的变化情况。本文的主要研究结果如下:
　　1、PCR-SSCP操作方法和参数的优化。首先，优化并确定了适合酒醅、大曲、窖泥的总基因组DNA提取方法;其次，比较并确定一种染色时间短且效果好的银染方法;最后，优化并确定了SSCP的操作参数。研究结果表明:变性缓冲液与样品体积比为2∶1，凝胶浓度为14％，丙烯酰胺与双丙烯酰胺质量比为49∶1，恒压300V，4℃电泳18h。
　　2、酒醅原核微生物群落分析。酒醅样品SSCP图谱条带数介于11-19条，不同发酵时间的原核微生物群落组成也不同，Shannon-Wiener多样性指数介于2.40-2.94之间，Sorenson相似性指数介于0.73-1.00之间。对图谱中3个条带进行回收并测序，显示样品中包含魏斯氏菌，乳酸菌和醋酸杆菌。
　　3、大曲原核微生物群落分析。大曲样品SSCP图谱条带数介于10-18条，不同发酵时间的原核微生物群落组成也不同，Shannon-Wiener多样性指数介于2.56-2.89之间，Sorenson相似性指数介于0.80-1.00之间。对图谱中5个条带进行回收并测序，显示样品中包含魏斯氏菌，乳酸菌，芽孢杆菌以及不可培的细菌菌属。
　　4、窖泥原核微生物群落分析。窖泥样品SSCP图谱条带数介于7-16条，Shannon-Wiener多样性指数介于1.95-2.83之间。同一发酵时间不同窖池的窖泥的原核微生物群落构成基本相同，Sorenson相似性指数介于0.92-0.96之间;不同发酵时间的原核微生物群落组成不同，Sorenson相似性指数介于0.78-0.96之间。对图谱中18个条带进行回收并测序，显示样品中包乳酸菌，乳杆菌以及不可培的细菌菌属。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 白酒发酵微生物

1．2 中国浓香型白酒窖池微生态系统

1．2．1 酒醅微生物区系

1．2．2 大曲微生物区系

1．2．3 窖泥微生物区系

1．3 微生物多样性的分子生物学研究方法

1．3．1 T-RFLP技术(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)

1．3．2 ARDRA技术(Amplifed Ribosomal DNA Restriction Analysis)

1．3．3 PCR-DGGE技术(DGGE-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

1．3．4 PCR-TGGE技术(PCR-Temperature Gradient Gel Electrophoresis)

1．3．5 PCR-SSCP技术(Single-Strand Conformation Polymorphism)

1．4 研究意义和内容

1．4．1 本研究的目的和意义

1．4．2 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验样品

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要实验仪器

2．1．4 主要溶液配制方法

2．2 实验方法

2．2．1 酒醅样品总基因组DNA的提取方法

2．2．2 大曲样品总基因组DNA的提取方法

2．2．3 窖泥样品总基因组DNA的提取方法

2．2．4 琼脂糖凝胶电泳

2．2．5 PCR扩增体系和反应条件

2．2．6 聚丙烯酰胺凝胶电泳操作参数的优化

2．2．7 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法

2．2．8 银染方法

2．2．9 数据分析

2．2．10 SSCP图谱条带的回收、测序与分析

3 结果与分析

3．1 酒醅样品总基因组DNA提取方法的优化

3．2 大曲样品总基因组DNA提取方法的优化

3．3 聚丙烯酰胺凝胶电泳操作参数的优化

3．3．1 变性缓冲液与样品比例的优化

3．3．2 聚丙烯酰胺凝胶浓度和交联度的优化

3．3．3 电泳温度的优化

3．4 银染方法的优化

3．5 酒醅原核微生物群落的分析

3．5．1 酒醅样品总基因组DNA的提取

3．5．2 酒醅样品16S rDNA的PCR扩增

3．5．3 酒醅原核微生物PCR-SSCP分析

3．5．4 酒醅原核微生物PCR-SSCP图谱条带的回收、测序与分析

3．6 大曲原核微生物群落的分析

3．6．1 大曲样品总基因组DNA的提取

3．6．2 大曲样品16S rDNA的PCR扩增

3．6．3 大曲原核微生物PCR-SSCP分析

3．6．4 大曲原核微生物PCR-SSCP图谱条带的回收、测序与分析

3．7 窖泥原核微生物群落的分析

3．7．1 窖泥样品总基因组DNA的提取

3．7．2 窖泥样品16S rDNA的PCR扩增

3．7．3 窖泥原核微生物PCR-SSCP分析

3．7．4 窖泥原核微生物PCR-SSCP图谱条带的回收、测序与分析

4 结论

5 展望

参考文献

攻读硕士学位期间发表论文情况

附录

致谢