乌梁素海湖滨湿地细菌与氨氧化细菌群落结构空间异质性成因分析

摘要

乌梁素海成为世界上沼泽化速度最快的湖泊之一，正向芦苇沼泽→碱蓬盐化草甸→白刺荒漠方向演化。本文探究了乌梁素海富营养化湖泊湿地演化过程中，水陆过渡带沉积物以及土壤中氨氧化细菌群落的组成、丰度、亲缘关系以及多样性变化，结合湿地理化因子探讨基质条件对氨氧化细菌群落结构的影响;以及细菌群落的组成、丰度以及多样性变化，结合土壤理化因子探讨其对细菌群落结构的影响。
　　本文采用湿地总DNA提取法提取沉积物和土壤总DNA，对氨氧化细菌群落的amoA基因构建克隆文库，并进行测序，分析湿地沉积物与土壤过渡带4个样点中氨氧化细菌群落结构的组成、丰度、亲缘关系以及多样性指标;分析基质条件变化对氨氧化细菌群落结构的影响;以及对细菌群落的16S rDNA基因进行高通量测序，分析各样品中细菌群落结构的组成、丰度以及多样性指标;土壤理化性质采用标准方法测定，分析其对细菌群落结构的影响。主要得到以下几方面的结论:
　　第一、建立了具有自主知识产权的新的快速高效沉积物微生物总DNA提取方法。本文首次采用重铬酸钾溶液处理沉积物样品，结合机械裂解与化学试剂裂解相结合的手段，直接裂解微生物细胞将其溶解于DNA提取缓冲液进而获得高质量的微生物总DNA。
　　第二、富营养化湖泊湿地水陆过渡带氨氧化细菌从与Nitrosomonas-like序列相似为主要优势类群向与Nitrosospira-like序列相似为主要优势类群转变，群落结构空间异质性成因主要由总氮和水溶盐总量这两个基质因子所主导。
　　第三、沼泽化湿地及其过渡带土壤中细菌群落形成空间异质性的重要环境因子为总磷、水溶盐总量和铵态氮。
　　第四、氮是富营养化湖泊形成的重要因子，本文提出关于富营养化湖泊沉积物过量氮元素去除的微生物学机制可能为:氨氧化细菌将铵态氮氧化为羟氨，进一步转化为亚硝态氮或硝态氮，这个过程耦合了硫化物的氧化过程，最终以氮气的形式将沉积物中的化合态氮化物转变为气态的氮气排放到大气中去以缓解含有大量氮元素的农田退水排入乌梁素海对其生态系统功能造成的影响。

目录

声明

摘要

第一章 导论

1．1 微生物生态学

1．2 土壤微生物多样性

1．3 湿地环境中的微生物生态

1．4 土壤微生物在生物地球化学循环中的作用

1．4．1 甲烷氧化和氨氧化过程的微生物学机制

1．4．2 甲烷氧化菌对碳素生物循环的影响

1．4．3 氨氧化菌对环境中氮素生物循环的影响

1．4．4 甲烷氧化与氨氧化过程的耦合

1．5 土壤微生物碳氮功能群多样性研究方法

1．6 微生物生态学研究技术进展

1．6．1 Biolog微生物自动鉴定系统

1．6．2 磷脂脂肪酸分析

1．6．3 限制性片段长度多态性

1．6．4 末端限制性片段长度多态性

1．6．5 随机引物扩增多态性

1．6．6 单链构象多态性

1．6．7 变性梯度凝胶电泳

1．6．8 实时荧光定量PCR

1．6．9 荧光原位杂交技术

1．6．10 稳定同位素标记

1．6．11 克隆文库

1．6．12 454高通量测序

1．6．13 PhyloChipTM芯片

1．6．14 GeochipTM芯片

1．7 生物信息学在微生物生态学中的应用

1．8 论文选题背景与技术路线

1．8．1 选题背景

1．8．2 技术路线

第二章 沉积物微生物总DNA快速提取方法的建立

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 研究区概况

2．2．2 样品采集与处理

2．2．3 理化性质测定

2．2．4 黑臭沉积物微生物总DNA快速提取方法建立的依据

2．2．5 PCR扩增验证

2．2．6 基因组DNA和PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

2．3 结果与分析

2．3．1 沉积物微生物总DNA快速提取方法

2．3．2 PCR评价效果

2．3．3 理化性质分析

2．4 讨论

第三章 氨氧化细菌群落结构空间异质性及其成因分析

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 样品采集与处理

3．2．2 沉积物／土壤微生物总DNA提取

3．2．3 氨氧化细菌amoA基因片段巢式PCR扩增

3．2．4 PCR产物纯化

3．2．5 PCR产物与pEASY-T1载体连接

3．2．6 制备大肠杆菌感受态细胞

3．2．7 转化

3．2．8 转化子DNA提取

3．2．9 菌落PCR鉴定重组克隆

3．2．10 测序数据分析

3．3 结果与分析

3．3．1 沉积物／土壤微生物总DNA提取与氨氧化细菌amoA基因扩增

3．3．2 氨氧化细菌amoA基因多样性分析

3．3．3 氨氧化细菌amoA基因亲缘关系分析

3．3．4 氨氧化细菌群落结构空间异质性成因分析

3．4 讨论

第四章 细菌群落结构空间异质性及其成因分析

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 样品采集与处理

4．2．2 沉积物／土壤微生物总DNA提取

4．2．3 16S rDNA V1-V3区PCR扩增

4．2．4 PCR产物纯化与测序

4．2．5 测序数据生物信息分析

4．3 结果与分析

4．3．1 高通量测序数据

4．3．2 细菌群落结构的组成、丰度与多样性

4．3．3 细菌群落结构的空间异质性成因分析

4．4 讨论

第五章 主要结论与创新

5．1 主要结论

5．2 创新之处

5．3 下一步工作设想

参考文献

致谢

附录

博士期间参与课题和论文发表情况