mTOR信号通路在牛乳腺上皮细胞甘油三脂和脂肪酸合成中的作用

摘要

乳脂肪含量与组成是构成牛奶重要营养品质的主要物质基础之一。牛乳脂肪的主要成分是甘油三酯，乳腺细胞以细胞内合成和胞外摄取两种形式获得脂肪酸并进一步合成甘油三酯。乳脂合成过程受到乳腺细胞内外营养因素和信号转导通路的调控，其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target ofrapamycin，mTOR)信号通路起着重要的作用。奶牛乳腺炎是一种奶牛常见病，影响牛奶中甘油三酯含量和脂肪酸的组成，无乳链球菌(S.agalactiae)是奶牛乳腺炎的重要病原体之一。本研究以奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究在胰岛素刺激条件下和无乳链球菌侵染时，细胞中甘油三酯和脂肪酸合成的变化情况，并对mTOR信号通路在其中所起作用进行初步探讨。
　　本实验通过乳汁分离法得到纯化的奶牛乳腺上皮细胞，(1)通过抑制剂（rapamycin）和RNA干扰技术抑制mTOR信号通路活性，或过表达Rheb激活mTOR信号通路，western blot检测甘油三酯合成关键酶的表达、ELISA检测甘油三酯含量以及软质酸、DHA的变化;(2)胰岛素刺激奶牛乳腺上皮细胞，ELISA检测甘油三脂含量变化，GC-MS检测细胞内37种脂肪酸含量的变化;(3)无乳链球菌侵染奶牛乳腺上皮细胞，ELISA检测甘油三脂含量变化，GC-MS检测细胞内37种脂肪酸含量变化。
　　结果表明:(1) mTOR信号通路特异性抑制剂rapamycin显著抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖(p＜0.01)、mTOR信号通路活性和甘油三脂合成关键酶DGAT1的表达;(2)100 nM rapamycin处理奶牛乳腺上皮细胞8h，软脂酸、DHA和甘油三脂的含量都有明显下降(p＜0.01);(3) Rheb基因转录后沉默，降低mTOR信号通路活性和甘油三脂合成关键酶Lipin1和DGAT1的表达，甘油三脂合成减少(p＜0.05);(4)过表达Rheb基因，增强mTOR信号通路活性和Lipin1和DGAT1的表达，甘油三脂合成增多(p＜0.01);(5)5 mg/ml胰岛素刺激细胞12h，甘油三酯合成量与对照组相比，有显著性提高(p＜0.05)，rapamycin对这一过程有抑制作用;(6)胰岛素诱导细胞内脂肪酸的合成;(7)短时间(2 h)无乳链球菌侵染细胞诱导甘油三酯合成和分泌(p＜0.01)，使脂肪酸的组成发生变化。
　　综上所述，本实验证明mTOR信号通路在牛乳腺上皮细胞甘油三脂和脂肪酸合成中发挥正向调控作用，其机制可能是调控了合成过程中关键酶的表达。胰岛素诱导细胞内甘油三酯和脂肪酸的合成，而无乳链球菌侵染则导致细胞内脂肪酸组成发生变化。这些过程中有mTOR信号通路参与，具体机制还需进一步研究。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 文献综述

1．1雷帕霉素(rapamycin)和mTOR信号通路

1．1．1 吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)及其代谢产物雷帕霉素

1．1．2 mTOR信号通路

1．2 奶牛乳腺上皮细胞及其原代培养

1．2．1 奶牛乳腺上皮细胞的分离

1．2．2 原代培养奶牛乳腺上皮细胞的意义

1．3 mTOR信号通路在乳脂合成中的调控作用

1．3．1 对脂质合成基因表达相关转录因子SREBPs和PPARs的调控作用

1．3．2 在脂肪酸从头合成中的作用

1．3．3 在长链脂肪酸摄取和转运中的作用

1．3．4 在脂肪酸酯化和甘油三酯合成中的作用

1．4 无乳链球菌以及奶牛乳腺炎

第二章 mTOR信号通路在乳脂合成中的调控作用

2．1 材料

2．1．1 细胞系以及质粒

2．1．2 主要试剂及仪器

2．2 方法

2．2．1 乳汁分离法分离奶牛乳腺上皮细胞

2．2．2 rapamycin对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响

2．2．3 rapamycin处理奶牛乳腺上皮细胞后对mTOR信号通路的影响

2．2．4 rapamycin处理奶牛乳腺上皮细胞后对超长链脂肪酸延伸酶以及甘油三脂合成关键酶的影响

2．2．5 rapamycin处理奶牛乳腺上皮细胞后对脂肪酸以及甘油三脂合成的影响

2．2．6 Rheb基因转录后沉默对甘油三脂合成的影响

2．2．7 Rheb基因过表达对甘油三脂合成的影响

2．3 实验结果

2．3．1 乳汁分离法分离得到奶牛乳腺上皮细胞

2．3．2 rapamycin抑制奶牛乳腺上皮细胞增殖且具有时间依赖性

2．3．3 rapamycin处理奶牛乳腺上皮细胞抑制mTOR信号通路的活性

2．3．4 rapamycin抑制ELOVL1和DGAT1的表达

2．3．5 rapamyciny抑制软脂酸、DHA和甘油三脂的合成

2．3．6 Rheb基因转录后沉默抑制甘油三脂合成

2．3．7 Rheb基因过表达促进甘油三脂合成

2．4 讨论

第三章 mTOR信号通路介导胰岛素信号对奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯和脂肪酸合成的影响

3．1 材料

3．1．1 细胞系

3．1．2 主要试剂及仪器

3．2 实验方法

3．2．1 胰岛素处理时间与处理浓度的优化

3．2．2 胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞中甘油三脂合成的影响

3．2．3 胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞中的脂肪酸合成的影响

3．3 实验结果

3．3．1 胰岛素促进甘油三脂合成具有时间依赖性

3．3．2 rapamycin抑制胰岛素诱导的甘油三脂合成

3．3．3 rapamycin抑制胰岛素诱导的脂肪酸合成

3．4 讨论

第四章 无乳链球菌侵染对奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯和脂肪酸合成的影响

4．1 材料

4．1．1 细胞系以及菌株

4．1．2 主要试剂及仪器

4．2 实验方法

4．2．1 无乳链球菌侵染奶牛乳腺上皮细胞的条件优化

4．2．2 无乳链球菌侵染对奶牛乳腺上皮细胞中甘油三脂合成的影响

4．2．3 无乳链球菌侵染对奶牛乳腺上皮细胞中脂肪酸合成的影响

4．3 实验结果

4．3．1 无乳链球菌侵染奶牛乳腺上皮细胞的条件优化

4．3．2 短时间无乳链球菌侵染诱导奶牛乳腺上皮细胞甘油三脂的合成和分泌

4．3．3 短时间无乳链球菌侵染影响细胞内脂肪酸的组成

4．4 讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文

附录