硒对S.aureus诱导的奶牛乳腺上皮细胞Nod2/MAPK/mTORs信号通路关键蛋白表达的影响

摘要

【目的】硒(Se)能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌(S. aureus)感染的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【方法】首先将bMECs以10^6细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用含2、4和8μmol·L^-1浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12 h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组,即对照(Con)组(bMECs)、模型(Mod)组(bMECs+S. aureus)和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组(bMECs+2μmol·L^-1 Se+S. aureus)、Mid组(bMECs+4μmol·L^-1 Se+S. aureus)和Hig组(bMECs+8μmol·L^-1 Se+S. aureus),每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。【结果】S. aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平(P<0.01)。S. aureus感染0.5 h后,Nod2蛋白水平显著升高(P<0.01)。在培养基里添加2μmol·L^-1的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L^-1的硒可显著抑制Nod2的表达(P<0.05);S. aureus感染0.5 h后,RIP2蛋白水平显著升高(P<0.05),而在培养基里添加8μmol·L^-1硒可显著抑制RIP2蛋白的表达(P<0.05);S. aureus感染0.5 h后,与对照组相比,模型组JNK蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L^-1的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.05),在培养基里添加8μmol·L^-1的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01);S. aureus感染0.5 h后,与对照组相比,模型组AKT蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.01)。在培养基里添加4μmol·L^-1硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平(P<0.01),在培养基里添加8μmol·L^-1硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平(P<0.05);S. aureus感染0.5 h后,模型组mTOR蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.01)。在培养基里分别添加4μmol·L^-1和8μmol·L^-1硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平(P<0.05)。【结论】硒可通过抑制bMECs Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键因子蛋白的表达而减轻S. aureus诱导的bMECs炎症反应。