利用原核显微注射技术制备HIF-1α转基因小鼠及其表达检测

摘要

HIF-1α即乏氧诱导因子-1α是HIF-1异源二聚体结构的一个亚基。HIF-1是PAS(PER-ARNT-SIM)转录因子家族的成员之一，主要通过与靶基因结合进而调节靶基因的转录来发挥功能。其作用主要集中于介导机体的缺氧缺血等适应性反应。而HIF-1α亚基是HIF-1转录因子的活性调节亚基，它决定了HIF-1转录因子具有活性并行使其功能。血管内皮生长因子（VEGF）是血小板衍生性生长因子家族的成员之一，它被证明具有促进毛囊发育和毛发生长的作用，同时也被证明是HIF-1α的靶基因之一。本实验利用CISPR/Cas9基因打靶系统将HIF-1α基因整合到小鼠Rosa26基因位点上来探讨HIF-1α对毛囊发育等的影响。本实验制作转基因小鼠的方法为原核显微操作技术。利用该方法获得HIF-1α转基因小鼠之后，首先利用PCR来筛选阳性小鼠;之后通过Real-time PCR的方法检测转基因小鼠皮肤组织中HIF-1α、VEGF的mRNA的相对表达量;再通过Western Blot检测转基因小鼠皮肤组织中HIF-1α、VEGF的蛋白表达水平。
　　1、HIF-1α过表达载体的构建及功能的检验
　　研究HIF-1α对毛囊发育与生长的关系则需研究HIF-1α与其靶基因VEGF的关系，验证HIF-1α的过表达是否真正引起其靶基因VEGF、eNOS的变化，是否在HIF-1α/VEGF/VEGFR2的信号通路中起作用。
　　本实验首先从小鼠基因组中克隆出HIF-1α基因并成功构建了过表达载体。将该载体通过电穿孔转染法成功转入小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)中，通过实时定量PCR的检测，以非转基因MEF为对照组，转基因MEF中基因HIF-1α的mRNA的表达量为对照组的17.91倍，VEGF mRNA的表达量为对照组的15.49倍，VEGFR2 mRNA的表达量为对照组的6.13倍，eNOS mRNA的表达量为对照组的2倍;通过Western Blot的检测，转基因MEF中HIF-1α的蛋白表达量为对照组的2.41倍，VEGF的蛋白表达量为对照组的1.79倍。说明过表达HIF-1α确实引起了其靶基因VEGF，eNOS的上调，也同时引起VEGFR2的上调。
　　2、HIF-1α基因定点整合载体的构建
　　本实验利用CISPR/Cas9基因打靶系统进行基因编辑，因此需要三个载体:Cas9载体、sgRNA载体以及HIF-1α同源重组载体。本实验选取的靶位点为Rosa26第一内含子1096bp处，由于该位点之前在本实验室已实现过同源重组插入目的基因的先例因此Cas9载体、sgRNA载体直接使用本实验室存留载体。同时通过扩增上游同源臂、人源K14启动子、目的基因HIF-1α并加入合适酶切位点最终成功构建HIF-1α同源重组打靶载体。经过一系列酶切鉴定正确后再经过测序该载体同源性达到100％，因此认定打靶载体构建成功。
　　3、定点整合载体相关细胞检测
　　本实验主要使用电穿孔转染法将Cas9载体、sgRNA载体以及HIF-1α同源重组载体导入MEF中，培养48h之后提取基因组。本实验筛选出两对引物:一对用来检测目的基因HIF-1α是否成功整合到细胞基因组中即检测随机整合引物;另一对用来检测目的基因是否如预期插入靶位点。以转染后的细胞基因组为模板用以上两对引物进行PCR反应，反应产物条带大小符合预期，经测序正确。以上两对引物可用于后续进行转基因小鼠检验。
　　4、转基因小鼠的制备
　　本实验主要通过原核注射的方法制备转基因小鼠，该方法首先需要准备注射用外源基因，其次即原核时期受精卵的获得，然后进行注射，最后完成胚胎移植。本实验一共制备了原代小鼠56只，经PCR鉴定其中有2只HIF-1α随机整合阳性小鼠，并未得到定点整合的小鼠。为后期研究HIF-1α基因与毛囊发育的关系构建了转基因小鼠模型和相关实验材料。
　　5、HIF-1α转基因小鼠的表达水平检测
　　本实验对已筛选出的两只随机整合阳性小鼠661号、664号的皮肤组织进行HIF-1α的表达水平的检测。该实验以同批非转基因小鼠682号为对照，首先通过实时定量PCR进行mRNA水平的检测，以α-tublin为内参基因，检测结果为661号小鼠的HIF-1α mRNA表达量是对照小鼠的7.75倍，VEGF mRNA的表达量是对照小鼠的29.62倍;664号小鼠的HIF-1α mRNA表达量是对照小鼠的3.41倍，VEGF mRNA的表达量是对照小鼠的2.91倍。然后通过Western Blot进行蛋白水平的表达的检测，同样以α-tublin为内参基因，实验结果显示661号小鼠的HIF-1α蛋白表达量是对照小鼠的2.02倍，VEGF蛋白表达量是对照小鼠的1.72倍;664号小鼠的HIF-1α蛋白表达量是对照小鼠的1.84倍，VEGF蛋白表达量是对照小鼠的1.54倍。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 CRISPR／CAS系统及HIF-1α基因的介绍

1 CRISPR／CAS系统

1．1 CRISPR／CAS系统的发现与结构

1．2 CRISPR／CAS系统的作用机制

1．3 CRISPR／CAS系统面临的问题和研究进展

2 HIF-1α基因的介绍

2．2 HIF-1α基因与毛囊发育的关系

第二章 利用原核显微注射技术制备HIF-1α转基因小鼠及其表达检测

1．2 HIF-1α基因定点整合载体的构建

1．3 定点整合载体细胞水平的检测

1．4 转基因小鼠的制备

1．5 HIF-1α转基因小鼠的表达水平检测

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3．结果

3．1 HIF-1α过表达载体的构建及功能的检验

3．2 HIF-1α基因定点整合载体的构建

3．3 定点整合载体细胞水平的检测

3．4 转基因小鼠的制备

3．5 HIF-1α转基因小鼠的表达水平检测

4．讨论

4．2 HIF-1α基因定点整合载体的构建

4．3 定点整合载体细胞水平的检测

4．4 转基因小鼠的制备

4．5 HIF-1α转基因小鼠的表达水平检测

结论

参考文献

附录

致谢