竞争性抑制缺氧诱发因子1α与VHL蛋白结合的多肽对血管形成的促进作用

摘要

缺血性心脏病是世界上发病率及死亡率最高的疾病。当药物不足以达到治疗目的时，通常需要进行经皮冠状动脉内支架术或冠状动脉搭桥术来进行血管重建。然而，仍然有一部分患者无法进行介入性血管重建术，这些患者通常患有弥漫性冠状动脉病变、缺乏适当的血管进行搭桥术、远端冠状动脉狭小、合并其他严重的系统性疾病或一些血管重建术后发生再狭窄的患者。由于心肌梗塞面积与侧支循环流量成负相关，治疗性血管形成的疗法通过改善缺血心肌的血供而改善患者的临床症状成为很有希望的新的治疗缺血性心脏病的方法。 目前VEGF及FGF家族的生长因子在治疗性血管形成中的作用得到了广泛的研究。结果表明它们能明显促进新生血管的形成，但新生的血管常伴有水肿、炎症和自发性出血性溃疡，将VEGF与其他促进血管形成的因子联合应用能减少新生血管的缺陷。于是人们将目光转向能调节多种促进血管形成因子表达的转录因子，即缺氧诱发因子-1(HIF-1)。研究表明，HIF-1诱导产生的新生血管在结构与形态上与正常血管相似，功能正常。而且，在缺氧情况下，HIF-1的表达增加，通过促进一系列目的基因的表达调节缺氧组织氧的需求与供应之间的平衡，促进缺氧细胞的成活。可见，提高HIF-1的表达及活性对于缺血性疾病的治疗有着很大的应用前景。 本课题用基因工程和分子生物学技术确定了HIF-1α与VHL结合的最小有效的区域，使之在细胞及组织中过表达，探讨过表达的结合区域是否能竞争性地抑制VHL蛋白与细胞内源性HIF-1α的结合，从而稳定HIF-1α蛋白，解除VHL蛋白对HIF-1α活性的抑制作用，促进HIF-1目的基因的转录，促进血管形成，为缺血性疾病的治疗提供新的方法。 方法： 1.质粒重组体的制备 2.细胞培养与短暂性转染实验 3.缺氧反应元件(HRE)驱动的虫萤光素报告基因产物活性的分析：将不同的载有VHL结合区域的质粒重组体分别与HRE驱动的虫荧光素报告基因一起转染至不同细胞中。44小时后分析虫荧光素活性。HRE驱动的报告基因产物的活性代表内源性HIF-1α的活性。 4、免疫共沉淀反应：用体外免疫共沉淀反应分析VHL蛋白与HIF-1α不同片段及突变体的结合。用体内免疫共沉淀反应分析细胞提取物中内源性HIF-1α蛋白水平的变化。沉淀的蛋白经聚丙烯凝胶蛋白电泳分离后分别用放射性自显影或WesternBolotting进行检测。 5.蛋白电泳及WesternBolotting：用聚丙烯凝胶蛋白电泳的方法分离免疫沉淀的蛋白或全细胞提取物中的蛋白，转到硝化纤维素膜上，用抗FLAG-M2单克隆抗体检测转染至细胞内的HIF-1α不同片段的表达；用抗HIF-1α单克隆或多克隆抗体检测细胞内源性HIF-1α蛋白水平的变化。 6.共聚焦显微镜的观察：在盖玻片上培养HepG2细胞，将载有GFP基因的质粒短暂性转染至细胞内44小时后，用4％的多聚甲醛在室温下固定细胞。在共聚焦显微镜下观察表达的蛋白在细胞内的分布，分别观察约200个细胞，分为绝对核内分布(N)、核内分布大于胞浆分布(N＞C)及核内分布等于胞浆分布(N=C)。 7.鼠角膜血管形成的分析：根据Cao等1988年描绘的方法将化学合成的多肽包裹在硫酸蔗糖铝微球表面，植入眼角膜下，五天后用裂隙灯观察角膜内新生血管的形成。 8.统计学分析：所有数值用均数±标准差表示，各组之间行t检验，P＜0.05为显著性差异。 结果：一、在细胞内过表达的VHL结合区域对细胞内源性HIF-1α蛋白及其活性的影响 1.体内免疫共沉淀反应及蛋白表达的检测结果表明在未转染VHL结合区域的细胞中，内源性HIF-1α蛋白因为很快被降解而很难检测到。当VHL结合区域mHIF-1α(546-574)在细胞内过表达后，可以检测到稳定的HIF-1α蛋白，约120kDa。 2.HRE驱动的虫萤光素报告基因产物的活性分析显示，作为对照组，在细胞内过表达FLAG-GAL4对内源性HIF-1α的活性无影响，VHL结合区域的过表达能提高内源性HIF-1α的活性，成剂量依赖性，与对照组FLAG-GA14相比，有显著性差异。 二、VHL结合区域稳定内源性HIF-1α蛋白、提高内源性HIF-1α活性的作用机制 1.体外免疫共沉淀反应的结果表明野生型的VHL结合区域能很好地与VHL蛋白结合，而脯氨酸563突变的VHL结合区域则不能与VHL结合。 2.在缺氧环境中培养的细胞内源性HIF-1α蛋白稳定，当恢复正常氧浓度培养5分钟后，在过表达脯氨酸563突变的VHL蛋白结合区域的细胞中，内源性HIF-1α蛋白被迅速降解，而在过表达野生型VHL结合区域的细胞中，内源性HIF-1α蛋白的降解被抑制。 3.HRE驱动的虫萤光素报告基因产物的活性分析显示野生型的VHL结合区域提高了内源性HIF-1α的活性，具有剂量依赖性，与相对应浓度的GAL4相比，有显著性差异。而过表达的脯氨酸突变的VHL结合区域则丧失了这一功能。 三、确定VHL结合区域中的关键氨基酸 在HepG2及鼠脑内皮细胞(MBEC)进行的HRE驱动的虫萤光素报告基因分析结果发现，与野生型VHL结合区域相比，除了P563A及PYI-DDD突变体已知不能结合VHL而丧失提高内源性HIF-1α活性的功能外，突变体D570A、L573A及FL571/573AA的功能也明显减弱或消失，说明氨基酸D570及L573在与VHL的结合中起着至关重要的作用。 四、确定与VHL结合的最小而有效的区域 1.体外免疫共沉淀反应结果显示，全长HIF-1α即mHIF-1α(1-822)及VHL结合区域HIF-1α(546-574)均与VHL蛋白结合，mHIF-1α(546-574)与VHL蛋白的结合大于全长HIF-1α。当羧基端的QL两个氨基酸残基被删除后则不能与VHL蛋白结合，所以羧基端保留至L573。从氨基端逐渐删除后，VHL结合区域与VHL蛋白的结合能力逐渐下降，mHIF-1α(559-573)与VHL蛋白的结合仍很强，而mHIF-1α(560-573)及mHIF-1α(561-573)与VHL蛋白的结合能力明显减弱。 2.HRE驱动的虫萤光素报告基因活性分析结果发现，VHL结合区域mHIF-1α(559-573)在内皮细胞中的作用最强，而在HepG2细胞中仍有效，其作用明显高于围绕脯氨酸402的VHL结合区域中的18个氨基酸的区域，表明HIF-1α(559-573)这个包含15个氨基酸的区域是最小而有效的VHL结合区域。 五、过表达的VHL结合区域在细胞内的分布对其活性的影响 1.对内源性HIF-1α蛋白水平的分析结果表明在没有经过MG132处理的细胞中，正常氧情况下，内源性HIF-1α不能被检测到，缺氧的环境使HIF-1α蛋白稳定，再给氧后内源性HIF-1α蛋白被迅速降解，在细胞核内6分钟后即达到半衰期，在细胞浆内降解更快，约4分钟后达半衰期。经MG132处理后，HIF-1α在细胞核及细胞浆内的降解过程受到抑制。这一结果表明，内源性HIF-1α的降解是由蛋白酶体介导的，这一过程即发生在细胞核内也发生在细胞浆内。 2.HRE驱动的虫萤光素报告基因活性分析及共焦显微镜观察结果显示，FLAG-GFP-HIF-1α(559-573)在细胞核及细胞浆内均有大量分布，其过表达后促进内源性HIF-1α的活性，呈剂量依赖性；而FLAG-GFP-NLS-HIF-1α(559-573)主要分布在细胞核内，只有少量分布在细胞浆内，其促进内源性HIF-1α活性的作用明显下降；当FLAG-GFP-NLS-HIF-1α(559-573)中的NLS被突变而丧失其核导入信号的作用后，这一VHL结合区域又呈全细胞分布，而且恢复了其对内源性HIF-1α活性的促进作用。 六、化学合成的含有VHL结合区域的多肽具有抑制HIF-1α与VHL蛋白的结合、促进血管形成的作用 为了证实VHL结合区域促进新生血管形成的作用，我们用化学方法在体外将VHL结合区域mHIF-1α(559-573)与HIV-1病毒的TAT蛋白中的转膜序列连接起来。

目录

英文缩略语

前言

材料及方法

实验结果

附图

讨论

结论

本研究新见解

参考文献

致谢

综述 缺氧诱发因子1：功能及其调节

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