Tourette综合征动物模型脑内5-羟色胺和多巴胺系统相互作用的研究

摘要

Tourette综合征(Tourettesyndrome，TS)是以持续运动和发音异常为特征的人类神经障碍性疾病。男女发病比例为5：1，发病率约为0.1～1％。常伴有注意缺陷多动障碍(attentiondeficit-hyperactivitydisorder，ADHD)和强迫性障碍(obsessive-compulsivedisorder，OCD)。TS的病因尚不清楚，一般认为TS的发病与遗传基因和神经递质系统的异常有关。包括多巴胺(Dopamine，DA)、5-羟色胺(serotonin，5-HT)和去甲肾上腺素(NorepinephrineNE)等神经递质在内的神经递质系统失衡也是TS的发病原因。也有人认为神经递质系统的失衡可能与皮层－纹状体－丘脑－皮层环路发育异常有关。神经递质失衡假说的提出是根据对有效治疗TS的药物作用机理的研究，对尸检患者脑组织神经递质含量的检测以及对患者PET/SPECT研究所得实验结果推知的。皮层－纹状体－丘脑－皮层环路中的神经递质，包括多巴胺能，5-羟色胺能，GABA能，谷氨酸能，胆碱能和肾上腺素能系统，相互影响，相互作用。其中哪一递质系统在TS发病机制中起到主要作用还不能确定。多数人认为DA系统起到主要作用，但由于各递质系统之间相互关联，很有可能存在几种递质系统间的作用不平衡。 临床应用抗精神病药物治疗TS，如氟哌啶醇，利培酮，这类药物都有DA受体阻滞作用。约80％患者经氟哌啶醇治疗后运动和发声抽动减轻或消失。尽管这类药物能有效的抑制抽动症状，但是由于具有嗜睡，肌肉强直及运动失调等副作用，不适合长期应用。因此，进一步深入研究TS的发病机制，寻找新的药物治疗靶点是至关重要的。 DOI[1-(2，5-dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane选择性5-HT(2A/2c)受体激动剂]在小鼠中可成功地诱导出耸肩、头部抽动(headtwitchresponse，HTR)等运动，该行为能部分模拟TS的临床表现，因此可作为TS的动物模型用于多种临床药物的药效评价。本研究应用DOI诱导大鼠头部抽动作为TS动物模型，检测纹状体内DA和5-HT的含量，并观察应用5-HT受体激动剂后，多巴胺能神经突触前多巴胺转运体和突触后多巴胺D1受体和D2受体的表达，从神经生物化学水平研究该动物模型头部抽动的发生机制，揭示在TS发病中5-HT与DA系统之间的关系。 材料与方法： 1.实验动物 健康雄性Wistar大鼠，体重180～220g由中国医科大学实验动物部提供。 2.大鼠头部抽动模型建立 选雄性Wistar大鼠，分笼饲养，常规饮食，随机分为实验组和对照组。实验组腹腔注射1mg/kg/d的DOI，诱导HTR大鼠模型，对照组腹腔注射相同剂量的生理盐水。连续给药15-20d诱导大鼠头部抽动。 3.大鼠纹状体多巴胺、高香草酸、5-羟色胺和5-羟吲哚醋酸的含量检测 取实验组和对照组大鼠各10只，断头处死，快速分离出纹状体，将纹状体准确称量后，加入5％的高氯酸100μl，用超声匀浆机匀浆破裂，离心。定量吸取上清液20μl，加入到高效液相色谱仪中测定DA、HVA、5-HT和5-HIAA的含量。 4.大鼠纹状体多巴胺转运体分布的检测 4.199mTc-TRODAT-1的标记 每支TRODAT-1加入新鲜洗脱的高锝酸盐注射液1.0ml(37～1110MBq)，室温下静置5min后，100℃沸水浴上加热30min，冷却即得99mTc-TRODAT-1，放射化学纯度大于90％。 4.299mTc-TRODAT-1在鼠脑内生物分布 取实验组和对照组大鼠各10只，经尾静脉注射99mTc-TRODAT-10.3ml(5.55MBq)，99mTc-TRODAT-1注射后60min断颈快速取出全脑，分离出纹状体、海马、大脑皮层，称重后用γ计数仪测定放射活性，计算每克脑组织含放射性占注射剂量的百分比(％ID/g)。 4.3放射自显影 取实验组和对照组大鼠各5只，经尾静脉注射99mTc-TRODAT-1666～740MBq，于注射后1h断颈快速取出全脑，称重后置于-25℃冰冻切片机内冷冻30min。进行冠状切片，片厚20μm，将载玻片放入4％多聚甲醛中固定10min，冷风吹干后在标本上涂一层核乳胶，外用黑纸包好，置-80℃冰箱曝光24h，曝光结束后取出进行显影、定影、HE染色，光镜下观察银颗粒在纹状体的分布情况。 5.前额叶皮层和纹状体多巴胺D1、D2受体mRNA表达的检测 在大鼠脑D1、D2受体基因cDNA序列中选取D1、D2受体mRNA编码区域序列，计算机自动设计引物。在最后1次给药后24h断头处死大鼠，取双侧纹状体和前额叶皮层组织，常规方法提取RNA，紫外分光光度计测定OD值定量RNA。采用逆转录试剂盒转录cDNA，PCR扩增，2％琼脂糖凝胶电泳，用图像分析系统测量分析，以D1、D2受体与β-actin扩增条带的吸光面积积分比值来评定D1、D2mRNA表达水平。 6.统计学处理对实验结果分别进行t检验和单因素方差分析，组间均数比较用Tukeys检验。以P＜0.05为有统计学意义。 实验结果： 1.动物模型 用药后实验组出现HTR行为，行为可持续2～3h，连续给药15d，大鼠HTR持续存在，HTR与自主地摇头、点头行为有明显区别，可明确地辨认出来。对照组无抽动行为。 2.大鼠模型脑纹状体内DA、HVA、5-HT和5-HIAA的含量DOI诱导的头部抽动大鼠与对照组相比DA、HVA含量降低，差别有统计学意义(P＜0.05)。DOI诱导的头部抽动大鼠与对照组相比5-HT和5-HIAA的含量降低，差别有统计学意义(P＜0.05)。 3.99mTc-TRODAT-1在鼠脑内生物分布 用γ计数仪测定脑组织各部位的放射活性，结果显示实验组和对照组大鼠纹状体中的放射活性有显著的统计学差异，即实验组大鼠99mTcTRODAT-1与DAT特异性结合显著高于对照组(P＜0.01)。在海马和大脑皮层，实验组和对照组大鼠放射活性也有统计学差异(P＜0.05)。99mTc-TRODAT-1在纹状体的分布高于海马和大脑皮层。 4.放射自显影检测多巴胺转运体含量 光镜下观察发现，注药后60min正常大鼠纹状体、大脑皮层均有银颗粒弥散分布，纹状体处的银颗粒分布相对密集，血管内银颗粒分布更加浓密。实验组大鼠脑内银颗粒浓聚，显著高于对照组，尤其是纹状体。在纹状体，银颗粒主要分布于基质，淡染的斑片结构处几乎见不到银颗粒。 5.前额叶皮层和纹状体多巴胺D1、D2受体mRNA表达的检测实验组大鼠前额叶皮层的D1受体mRNA表达较对照组明显增高(P＜0.05)，而D2受体mRNA没有明显的变化(P＞0.05)，纹状体的D1、D2受体mRNA表达与对照组相比均无明显的变化(P＞0.05)。 结论： 1.DOI诱导的鼠头部抽动模型不论在神经生物化学发病机理还是行为表现均与TS相似，可作为TS的动物模型，用于研究TS的发病机制及药物治疗。 2.5-HT和DA系统参与了TS的发病。两者的功能是相互影响、相互作用的。 3.DOI诱导的大鼠头部抽动TS动物模型纹状体DAT与特异性其配体结合率增高，突触前多巴胺神经元过度支配造成的DA系统活动过度可能是TS的发病原因之一。 4.DOI诱导的大鼠头部抽动模型前额叶皮层D1受体表达增高，说明5-HT可通过调节DA受体的表达影响DA递质系统的功能。皮层－边缘系统投射到纹状体的谷氨酸能神经元功能亢进可能是TS的发病原因。

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论文一DOI诱导的大鼠头部抽动模型纹状体内单胺神经递质的改变

论文二DOI诱导的大鼠头部抽动模型脑内多巴胺转运体的研究

论文三DOI诱导的大鼠头部抽动模型脑内多巴胺受体基因表达

本研究创新点

参考文献

综 述Tourette综合征神经生物学研究进展

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