用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达mAChR-Gα融合蛋白及其功能检测

摘要

mAChRs是GPCR家族中一员。通过cDNA克隆和在培养细胞中表达，5种mAChRs已被鉴定出来，具有GPCR经典的结构，即由紧密相邻的7个跨膜a螺旋所组成的三维结构构成，7个跨膜区(TMl-7)由3个胞外环(O1-3)和3个胞内环(i1-3)连接而成。N末端在胞外，C末端在胞内。奇数受体(m1，m3，m5)与Gq/11蛋白藕联，而偶数受体(m2，m4)与Gvo蛋白藕联。 GPCR-G蛋白融合蛋白是用来检测一个GPCR和单个G蛋白功能上相互作用的一种新方法。GPCR-G a融合蛋白的最显著的特点是：信号组分间具有精确的1:1信号定量关系；信号组分的空间位置相互比邻；将Ga紧紧锚定在细胞膜上。 目的: 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统生产m1AChR和G11a融合蛋白，分析在不同的毒蕈碱配体存在时，m1AChR-G11a融合蛋白中两组分之间的相互作用。 实验材料和方法: 1、材料 人类m1AChR亚型cDNAs(PEF-hm1)、牛G11a(GL2a)、Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(包括大肠杆菌E.coli DH5a感受态细胞、E.coli DH10Bac感受态细胞含Bacmid和Helper两种质粒、转座质粒pFastBacl、CelIfectin试剂)受赠于日本东京大学医学部脑研生化教研室Prof.T.Haga：草地贪夜蛾(Sf9)昆虫细胞株受赠于北京大学生命科学院陈建国教授；限制性内切酶BamH I、Sal I购自MBI公司；T4 DNA连接酶购自Invitrogen公司；TNM-FH昆虫培养基、标准胎牛血清、tryptose phosphate broth、LB培养基、X-gal、IPTG等购于Sigma公司；Axygen凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于Bioscience公司；[3H]QNB(比活性1.8PBq/mol)和[35S]GTPγS(比活性40.1 PBq/mol)购于Amersham Pharmacia公司；其它试剂都是分析纯试剂。 2、实验方法 (1)融合蛋白cDNA的构建m1AChR-G11a融合DNAs是用Taq DNA聚合酶通过二步PCR法得到的。在PCR1A中，m1AChR的DNA序列以PEF-hm1为模板，以m1-BamH I和m1-C末端为上下游引物；在PCR1B中，G11a的DNA序列以GL2a为模板，以m1AChR-G11a和G11a-Sal I为上下游引物扩增G11a DNA。在PCR2反应中，从PCR1A和PCR1B中回收的DNA片断退火，用PCR1A的正义引物和PCR1B的反义引物扩增。从PCR2扩增得到的DNA片断用BamH I和Sal I消化，然后克隆入用BamH I和Sal I消化过的pFastBacl中。PCR扩增得到的DNA片断用限制性内切酶序列分析法和酶分析法分析。 (2)重组杆状病毒的扩增、细胞培养和膜制备根据Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达m1AChR和m1AChR-G11a融合蛋白。制备融合蛋白的Sf9细胞膜。用细胞匀浆缓冲液Hepes-KOH(pH=8.0)，包括1mmol·L-1 EDTA、2mmol·L-1 MgCl2、0.5m mol·L-1 PMSF、5μg·ml-1 leupeptide、5μg·ml-1 pepstain、5 mmol·L-1 benzamidine重悬细胞碎片，分装小份储于-70℃冰箱中。 (3)[3H]QNB和[35S]GTPγS结合实验实验前，用HEN缓冲液重悬膜蛋白。表达m1AChR或m1AChR-G11a融合蛋白Sf9细胞膜用含有10mmol·L-1 [3H]QNB的100μl HEN缓冲液悬浮。在非特异性结合体系中，加入10μmol·L-1阿托品。在[35S]GTPγS结合实验中，不同配体存在时，0.3nmol·L-1 [35S]GTPγS和不同浓度的GDP和膜蛋白一起孵育60℃，30分钟。用2.5ml冷的Na+-K+缓冲液终止反应。用玻璃纤维滤膜滤过[3H]QNB或[35S]GTPγS，用2.5ml的冰冷的Na+-K+缓冲液冲洗，用Beckman液体闪烁计数器记数。 结果: 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功的表达了m1AChR和m1AChR·G11a融合蛋白。用毒蕈碱乙酰胆碱受体拮抗剂[3H]QNB特异性饱和结合实验测得的m1AChR蛋白和m1AChR-G11a融合蛋白的表达水平分别为24.03±2.13和45.3±2.16 nmol/g蛋白。 配体调节的GTPγS与G蛋白结合是研究GPCR-G蛋白偶联的一种敏感方法。毒蕈碱受体激动剂ACh加入到m1AChR的膜中没有导致内源性G11a蛋白的激活，然而，在m1AChR-G11α融合蛋白存在时，ACh引起了[35S]GTPγS与m1AChR-G11α结合量的显著增高。 不同配体的存在使融合蛋白中G11α与GDP的亲和力发生变化，ACh、卡巴胆碱、AF-267B、tiotropium bromide、telenzepine和阿托品以及无配体存在时，GDP的IC50分别是131.82、61.66、28.18、3.24、6.02和5.25 μmnol·L-1；在无配体存在时为16.60μmol·L-1。 结论: 1、用Bat-to-Bac杆状病毒表达系统可以成功表达m1AChR蛋白和m1AChR-G11a融合蛋白。 2、m1AChR-G11a融合蛋白成功表达为研究m1AChR后信号转导机制提供了便利条件，为m1AChR亚型特异性新药的开发和研制提供了有力的实验手段，同时也为临床上受体病新的治疗方法提供了崭新的思路和有力的证据。

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实验材料和方法

结果

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结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述：m受体-G蛋白信号传导途径研究进展

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