慢性吗啡依赖和戒断对大鼠远位触液神经元pCREB表达的影响

摘要

目的:接触脑脊液神经元(Cerebrospinal fluid contacting neuron CSF-CN)，简称触液神经元是中枢神经系统的一种特殊的细胞类型，依据其位置可分为室管膜(上)、室管膜下和远位触液神经元(distal cerebrospinal fluid contacting neuron)等三类，对于前两类细胞不少学者已进行了较深入的研究，不仅在光镜下观察到它们的存在，也报道了它们的超微结构化学特点及其功能。远位触液神经元不仅与脑实质内其他神经结构相互接触，也与脑脊液相接触，是真正把脑实质和脑脊液联系在一起的神经元，在脑与脑脊液之间的物质交流、信息传递和功能调控过程中，扮演着重要的角色。
　　 吗啡(morphine)戒断是指反复使用吗啡造成种身体依赖(physical dependent)，一旦停药或使用阿片类药物拮抗剂(如纳洛酮naloxone)，将发生一系列的生理功能紊乱状态，即戒断综合征。阿片依赖与脑细胞内信号转导通路有关。以往对吗啡依赖与戒断的研究主要集中于内源性阿片肽与阿片受体的关系，而受体后机制有待进一步研究。研究表明在吗啡依赖状态下，中缝背核通过。NO介导吗啡依赖和戒断的形成和发展。还有研究表明转录因子如环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)参与阿片类药物成瘾机制；吗啡依赖、戒断时，脑脊液中的物质成分会发生改变，慢性吗啡依赖、戒断可能与远位触液神经元相关。
　　 本研究通过注射吗啡，建立吗啡依赖及戒断模型；应用CB-HRP逆行追踪和pCREB免疫组织化学相结合的方法观察CREB在远位触液神经元中的表达，初步探讨触液神经元与吗啡依赖、戒断的关系，为远位触液神经元在吗啡成瘾中的作用提供形态学依据，为临床寻找有效的戒毒药物提供理论依据。
　　 材料与方法:
　　 一、实验材料
　　 1、动物及主要试剂
　　 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重220g～300g，由徐州医学院实验动物中心提供。吗啡系沈阳第一制药厂产品(批号040203)；纳洛酮系sigma公司的产品；pCREB抗体购于美国cell signaling试剂公司；免疫组化试剂盒由北京中杉金桥生物技术公司提供。
　　 2、主要仪器
　　 Olympus光学显微镜，Leica Tcs sp2激光共聚焦显微镜(德国)；UV22101紫外分光光度计(Shimadazu公司，日本)；垂直电泳仪(美国Bio-Band公司)；转移槽(美国Bio-Band公司)；低温离心机(日本HITACHI)；大鼠脑立体定位仪。
　　 二、实验方法
　　 1、慢性吗啡依赖及戒断模型建立及实验分组雄性SD大鼠，共分3组，每组8只，依赖组按逐日递增原则，每日吗啡用量分3次腹腔注射，注射时间分别为8:00、12:00、20:00。从第一天用量5mg/kg起，前6d每日递增15mg/kg，第7天起每日递增30mg/kg，直到第12天至260mg/kg，第13天即可使大鼠形成慢性吗啡依赖模型，模型成功后立即处死大鼠；慢性吗啡戒断组在慢性吗啡依赖后的次日(第13天)8:00，腹腔注射纳洛酮5mg/kg，催促戒断24h后处死。空白对照组同时间腹腔注射等体积的生理盐水。
　　 2、侧脑室注射CB-HRP所有大鼠在处死前48h腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，参照Paxinos和Watson《大鼠脑立体定位坐标图谱》[6]，将大鼠头部固定于脑立体定位仪，切开头顶部皮肤。侧脑室定位：Bregma：AP(1.2±0.4)mm，DV(3.6±0.4)mm，ML(1.4±0.4)mm。缓慢向单侧(左侧或者右侧)侧脑室注射30％CB-HRP3 ul，留针15min左右，动物置于相同的环境喂养48h。
　　 3、观察指标
　　 光镜观察，染色呈棕红色的为阳性细胞。阴性对照实验中，用PBS代替一抗或二抗，未见pCREB样染色的神经元。
　　 4、统计学处理所有数据采用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS13.0统计软件处理，多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)和q检验，以P<0.05为有统计学差异。
　　 结果:各组大鼠均见大量CB-HRP标记神经元，组间比较差异没有显著性(P>0.05)。吗啡依赖和戒断后大鼠脑片内的pCREB阳性数、CB-HRP/pCREB双标神经元的数目显著增加，分别约占远位触液神经元总数的76.2％和85.0％。空白对照组和抗体替换实验中仅见少量的pCREB阳性神经元，1～2个双标的阳性神经元，吗啡依赖和戒断组(P<0.01)。吗啡依赖组和戒断组的CB-HRP双重标记的神经元数目相似(P>0.05)。
　　 结论:
　　 1、慢性吗啡依赖和戒断可以引起中缝背核触液神经元的磷酸化CREB的表达增加。
　　 2、远位触液神经元不仅在脑-脑脊液之间的信息传递中起作用，而且通过增加pCREB的表达参与吗啡依赖和戒断的形成和维持。
　　 目的:神经病理性疼痛(neuropathic pain)是由外周或中枢神经系统的直接损伤或功能紊乱引起的疼痛，其临床表现有自发性疼痛、痛觉过敏，痛觉异常等。其发生机制复杂，至今尚未阐明，可能涉及中枢敏化、胶质细胞激活、细胞信号转导等多方面因素，而与触液神经元的关系则未见报道。在中枢神经系统中远位触液神经元不仅与脑实质内其他神经结构相接触，也与脑脊液相接触，是真正把脑实质和脑脊液联系在一起的神经元。在脑与脑脊液之间的物质交流、信息传递和功能调控过程中，扮演着重要的角色。
　　 细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinases，ERK1/2)是促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)对细胞内多种刺激介导信号转导反应。ERK1/2与细胞增殖和分化、神经元的可塑性，包括长时程增强效应、学习记忆等有关。新近的研究表明，ERK1/2不仅通过非转录过程产生短时程的功能性改变，而且通过增加基因的转录而产生长时程的适应性变化，藉此参与两种方式参与神经病理性疼痛痛敏反应的形成。
　　 P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)介导的细胞信号转导通路，主要在细胞增殖、分化、凋亡、神经元的可塑性等多种病理生理过程中发挥重要作用。最近的研究提示CCI诱导神经病理性疼痛后，大鼠脊髓P38MAPK磷酸化程度增加。脊髓小胶质细胞和背根神经节的P38MAPK活化促进神经病理性疼痛的形成。
　　 原癌基因c-fos参与神经细胞内痛信息传递或调控的进展，多种伤害性刺激，均可诱导相关中枢神经系统相关区域c-fos的表达，且表达的强度与刺激的强度成正相关。因此，原癌基因c-fos表达被人们认定为该神经核团或神经元与痛刺激相关的标志物。
　　 综上所述，迄今人们对触液神经元的递质分布及其与神经病理性疼痛的关系等，国内外尚无报道。为此，我们制作慢性坐骨神经压迫损伤模型(chronic contrctioninjury；CCI)诱导神经病理性疼痛模型来观察远位触液神经元在神经病理性疼痛作用，本研究应用CB-HRP逆行追踪和pERK1/2，p-p38MAPK，pCREB，c-Fos免疫组织化学相结合的方法观察细胞外信号调节激酶ERK1/2，p38MAPK，pCREB，Fos在远位触液神经元的表达，初步探讨ERK1/2，p-p38MAPK，pCREB，Fos远位触液神经元在神经病理性疼痛的关系，为远位触液神经元在神经病理性疼痛的作用提供依据。
　　 实验材料:
　　 一、实验动物及主要试剂
　　 1、雄性Sprague-Dawley大鼠，体重220-300 g，由徐州医学院实验动物中心提供。CB-HRP(30％)试剂购于中国协和医科大学；抗体pERK1/2、p38、pCREB抗体均购于美国cell signaling试剂公司；Fos抗体系美国Sigma公司产品。
　　 2、主要仪器
　　 大鼠脑立体定位仪(日本)；Lcica冰冻切片机(德国)；Olympus显微镜(日本)
　　 二、实验方法
　　 1、模型及分组
　　 实验用雄性SD大鼠，随机分为假手术组和坐骨神经结扎组，按Bennett GJ，Xie YK建立坐骨神经慢性损伤模型(CCI)，腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后，在左侧大腿中部切开，暴露出坐骨神经，在接近其分叉处用4-0丝线松扎4次，间隔1mm，逐层缝合切口。假手术组同实验组仅暴露出坐骨神经，但不结扎。
　　 2、技术方法
　　 采用CB-HRP追踪以及TMB-ST显色的组织化学、免疫组织化学双标技术相结合的方法。
　　 3、观察指标
　　 分别检测pERK1/2、p-p38、pCREB、Fos在大鼠脑实质内远位触液神经元的表达。
　　 4、统计学处理所有数据均以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析(one-wayANOVA)作组间比较，P<0.05认为有统计学差异。
　　 实验结果：
　　 1、CCI致神经病理性疼痛刺激后1d-14d，结扎组大鼠同侧后足热缩足反射潜伏期与基础值及假手术组比较均降低(p<0.01)。
　　 2、正常大鼠，该细胞簇内仅有个别神经元有CB-HRP/pERK1/2、CB-HRP/pCREB、CB-HRP/p-p38MAPK双重标记神经元；未见CB-HRP/Fos双重标记神经元；CCI术后1d，上述特定部位细胞簇的CB-HRP/pERK1/2、CB-HRP/pCREB、CB-HRP/Fos双重标记神经元数目较对照组增多(P<0.05)，而CB-HRP/p-p38MAPK双重标记神经元数目较对照组没有明显差异(P>0.05)。
　　 3、CCI术后3d，CB-HRP/pERK1/2双重标记神经元数目较对照组显著增多(p<0.01)，CB-HRP/pCREB、CB-HRP/Fos双重标记神经元数目较对照组增多(p<0.05)，而CB-HRP/p-p38MAPK双重标记神经元数目较对照组没有明显差异(p>0.05)。
　　 4、CCI术后5d、7d、14d，CB-HRP/p-p38MAPK、CB-HRP/pERK1/2、CB-HRP/pCREB、CB-HRP/Fos双重标记神经元数目较对照组显著增多(P<0.01)。
　　 结论：结扎大鼠坐骨神经可导致脑实质内远位触液神经元pERK1/2、p-p38、pCREB、Fos表达增加。