卡那霉素致小鼠耳毒性的分子机制:耳蜗外毛细胞马达蛋白Prestin的参与作用

摘要

目的：
　　 建立卡那霉素致小鼠耳毒性模型;明确小鼠耳毒性模型中,卡那霉素对耳蜗外毛细胞基底部外侧膜上表达的马达蛋白Prestin直接作用及其特点;探讨小鼠耳毒性模型中,卡那霉素耳毒性作用引起耳蜗内组织细胞的凋亡、凋亡信号转导途径及其发生特点;探讨卡那霉素所致的耳蜗内细胞凋亡与Prestin蛋白表达及功能之间的关联;建立转染Prestin基因的细胞株CHO-K1,在体外情况下,研究卡那霉素及细胞外的氯离子浓度对转染Prestin细胞的膜电位及细胞内的氯离子浓度的影响,从而进一步评估这些因素对Prestin功能的影响。
　　 方法：
　　 1、建立卡那霉素诱导产生的BALB/c小鼠耳毒性模型。
　　 2、听觉脑干反应(ABR)的检测:采用tone-pip声刺激,检测小鼠耳毒性模型在不同刺激声频率上的听觉阈值的变化,用以客观评估卡那霉素给药组与对照组的小鼠的听觉功能变化及其二者间的差异;
　　 3、免疫组织化学:应用耳蜗石蜡切片与免疫组织化学方法,探讨耳毒性引起的耳蜗外毛细胞的损害与对Prestin蛋白的影响二者间的关联;耳蜗基底膜硬铺片、原位免疫荧光染色、激光共聚焦显微成像技术相结合,以观察耳蜗外毛细胞马达蛋白Prestin的表达与耳毒性之间的相关性;采用耳蜗石蜡切片、TUNEL与免疫组织化学方法,研究卡那霉素耳毒性过程中,耳蜗内组织细胞的凋亡、凋亡信号转导途径及凋亡发生的特点。
　　 4、Real-timePCR检测:在卡那霉素不同用药时间组的小鼠耳蜗内,检测Prestin蛋白的RNA表达量,以观察卡那霉素在分子水平上对Prestin蛋白的作用;检测不同用药时间组的小鼠耳蜗内miR-34a,miR-34c的表达,研究二者是否参与了AmAn的耳毒性所导致的耳蜗内组织细胞凋亡的调控过程。
　　 5、转染Prestin-pcDNA3.1(-)的质粒到细胞株CHO-K1,通过药物筛选建立体外高表达Prestin蛋白的细胞株,并采用荧光探针染料标记结合显微荧光成像记录技术,研究卡那霉素及细胞外的氯离子浓度对高表达Prestin蛋白的细胞膜电位与细胞内的氯离子浓度的影响。通过卡那霉素体外诱导转染细胞的凋亡,观察Prestin蛋白与细胞凋亡之间的关系。
　　 结果：
　　 1、成功建立卡那霉素致BALB/c小鼠耳毒性模型。
　　 2、在卡那霉素所致的小鼠耳毒性过程中,用药组小鼠的各刺激声频率上的ABR阈值上移,与用药时间呈正相关性,而对照组的ABR听觉阈值则没有明显变化;用药10天后,用药组与对照组间ABR听觉阈值存在极显著性差异;高频率(≥24kHz)的ABR听觉阈值较早(用药7天后)发生改变,而低频率(≤8kHz)的ABR听觉阈值改变则相对较晚。
　　 3、耳蜗外毛细胞的损害程度与用药时间之间具有正相关性;外毛细胞马达蛋白Prestin的表达量及表达位置发生变化;Prestin蛋白的RNA表达量也受到卡那霉素耳毒性的影响,表达量减少,与用药时间之间存在着负相关性。
　　 4、各用药组的耳蜗石蜡切片TUNEL检测,显示耳蜗内组织细胞出现凋亡现象,且与用药时间呈一定的正相关性。
　　 5、免疫组织化学检测凋亡信号途径,以Calpain介导的细胞凋亡信号最为明显,Calpain蛋白的表达与用药时间呈一定的正相关性。
　　 6、Real-time PCR检测参与细胞凋亡调控的miR-34a在耳蜗内表达量与用药剂量呈正相关性;而另一参与细胞凋亡调控的小分子RNA-miR-34c的表达在用药组与对照组之间比较无显著性差异。
　　 7、卡那霉素作用于转染后高表达Prestin蛋白的CHO-K1细胞,能够使细胞内的氯离子浓度升高,细胞膜电位去极化;去除细胞外溶液的氯离子,也能够使细胞膜电位去极化,细胞内的氯离子浓度轻微升高;Prestin转染组和对照组之间比较,卡那霉素与去除细胞外的氯离子对细胞膜电位的影响无显著差异性,去除细胞外的氯离子对于细胞内的氯离子浓度的改变也无差异性,但卡那霉素升高细胞内的氯离子浓度却在两组之间存在着极显著性差异。
　　 8、卡那霉素作用于转染细胞,可引起细胞的凋亡,与用药时间呈正相关性;转染Prestin的细胞的凋亡率明显高于对照组。
　　 讨论：
　　 我们的研究表明,在卡那霉素所致小鼠耳毒性模型中,模型小鼠的听觉ABR阈值上移,高频率闽值改变早于低频率阈值改变,这是由于卡那霉素的耳蜗毒性损害是先从耳蜗基底部开始,并向耳蜗顶部发展,而耳蜗基底部主要是对高频声敏感,耳蜗顶部则是对低频声敏感,因此卡那霉素耳毒性损害先影响高频段听觉,后作用于低频段听觉。
　　 实验结果显示,在卡那霉素的耳毒性过程中,外毛细胞及其它一些内耳组织细胞发生了凋亡性死亡,Calpain信号转导途径是其中一个重要的凋亡途径,这可能是由于卡那霉素的耳毒性作用使得细胞内的钙离子浓度升高,致Calpain蛋白过度激活,引起细胞骨架和细胞膜的崩溃,膜蛋白,各种激酶,磷酸酶以及转录因子都受到严重影响,最终导致细胞凋亡。
　　 研究已经表明,细胞内的氯离子浓度对于Prestin蛋白功能具有重要影响,细胞内的氯离子可以作为Prestin蛋白的“电压感受器”,感受细胞膜电位变化,促进Prestin蛋白的构象改变。将细胞内的氯离子完全去除后,Prestin蛋白的功能则全部丧失,由此可知,细胞内的氯离子浓度的变化对于Prestin蛋白功能具有直接的影响。细胞膜电位的变化也对Prestin蛋白的功能至关重要。当细胞膜电位去极化时Prestin蛋白“收缩”,导致细胞“缩短”;反之当细胞膜电位超极化时,Prestin蛋白“伸长”,细胞则伸长。因此通过观察卡那霉素作用于高表达Prestin蛋白的细胞,细胞膜电位以及细胞内的氯离子浓度的变化,以此间接地评估对Prestin蛋白功能的影响。除了研究卡那霉素对细胞的直接作用外,还通过改变细胞外的氯离子浓度,观察对转染细胞的细胞膜电位及细胞内的氯离子浓度影响。
　　 实验结果显示,卡那霉素可以直接影响细胞膜电位,使细胞膜电位去极化,但作用在Prestin转染组与对照组细胞之间没有明显差别,表明卡那霉素对细胞膜电位的影响是非特异性的。这种作用可能是由于卡那霉素与细胞膜上的磷酸肌醇相结合后,导致细胞内的钙离子浓度升高,细胞去极化。
　　 因此我们认为,AmAn的急性耳毒性作用很可能是由于它们引起外毛细胞的膜电位及细胞内的氯离子浓度改变,直接或间接地导致外毛细胞膜上的Prestin蛋白的功能受到了影响,而这种急性耳毒性作用是快速、可逆的,随着停药后耳蜗内的AmAn逐渐清除,外毛细胞恢复正常状态和功能,受损的听觉功能逐渐恢复。至于长期应用AmAn所引起的耳毒性作用,则是由于激活了其它的损伤应激机制,如细胞的凋亡,外毛细胞凋亡坏死,缺失,Prestin蛋白表达位置发生改变,表达量减少,功能受到严重影响,由此导致的听觉功能是不可逆性的损害。
　　 综上所述,在AmAn耳毒性作用过程中,最初在外毛细胞的损害出现之前,AmAn可能直接作用于Prestin蛋白,影响其功能,也可能通过作用于Prestin蛋白的RNA合成阶段,从而影响调控Prestin蛋白的表达及功能,最终导致听觉功能的下降,产生AmAn的急性耳毒性作用,这个过程是快速的,可逆的,如能够及时去除AmAn的作用,听觉功能会逐渐恢复;如果不能及时停止AmAn耳毒性作用,将导致外毛细胞凋亡、缺失,Prestin蛋白表达量严重减少,表达位置也发生改变,由此导致听觉功能的永久性损害。这对于我们临床预防和治疗AmAn的耳毒性具有重要的参考价值。在临床长期应用AmAn药物时,应及时监测患者的听觉功能,并应注意对早期耳毒性先引起高频听觉(12kHz至16kHz)损害进行检测,发现听觉功能早期损害时,应及时调整用药,或是停药一段时间,待听觉功能恢复后再继续治疗。
　　 结论：
　　 1、在动物模型中,长期大剂量应用卡那霉素可以引起慢性耳毒性作用,听觉功能损害随着用药时间的延长而加重,听觉阈值升高,高频听觉功能较早受损。
　　 2、卡那霉素致小鼠耳毒性过程中,引起耳蜗内细胞凋亡性死亡,且与用药时间具有正相关性。
　　 3、在耳蜗内细胞凋亡过程中,以Calpain(钙调蛋白)信号转导途径为主,Calpain蛋白表达上调,且与用药时间具有一定的正相关性。
　　 4、miR-34a参与了卡那霉素所致耳蜗内细胞凋亡的调控,其表达量与用药时间及细胞凋亡的严重程度呈正相关性。
　　 5、卡那霉素慢性耳毒性过程中,导致外毛细胞崩溃、死亡、缺失,引起Prestin蛋白的表达量减少,与用药时间呈正相关性,Prestin蛋白的表达位置也发生改变;卡那霉素也可以直接地影响Prestin蛋白的RNA合成,随着用药时间的延长,耳蜗Prestin蛋白的RNA含量逐渐减少,其改变明显先于外毛细胞及prestin蛋白表达的形态学变化。
　　 6、在体外建立高表达Prestin蛋白的CHO-K1细胞株,研究显示,卡那霉素与细胞外的氯离子浓度的改变都可以非特异性地影响细胞的膜电位,使细胞去极化;卡那霉素可以显著性地升高转染表达Prestin蛋白的细胞内的氯离子浓度。细胞膜去极化及细胞内的氯离子浓度的改变都会进一步影响到膜上表达的Prestin蛋白的功能。
　　 7、卡那霉素可以引起细胞的凋亡,转染Prestin的细胞较对照组凋亡率显著性升高,且与用药时间呈正相关性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

论文一 卡那霉素对小鼠听觉功能及外毛细胞马达蛋白Prestin表达的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 卡那霉素致小鼠耳毒性过程中耳蜗细胞凋亡的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 卡那霉素对prestin转染的CHO-K1细胞功能的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 哺乳动物耳蜗外毛细胞的马达蛋-Prestin

在学期间科研成绩

致谢

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