β-榄香烯对大鼠骨髓来源内皮祖细胞分化及分化过程中Notch信号通路的影响

摘要

内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）是一类参与循环增殖并能分化为血管内皮细胞（endothelial cells，EC），但还未能表达成熟血管内皮细胞表型、也未形成微血管的前体细胞。胎儿出生后，EPC主要定居于骨髓。随着对EPC研究的深入，越来越多的证据表明EPC在肿瘤血管生成中起到重要作用。EPC分化为内皮细胞（endothelial cell，EC）是其功能发挥过程中的关键环节。
　　 目前对EPC分化的研究主要从形态和细胞表面标志两方面入手。在形态学无法将EPC与其他细胞区分开来，所以主要靠分子标志识别。CD133是新近发现的干细胞标记，不表达于成熟EC，被认为是目前区分血管EPC与EC的最主要标记[1，2]。vWF（von Willebrand因子）贮存在EC的Weibel-Palade小体中，血浆中vWF绝大部分系由EC分泌，它是血管内皮的分子标志物。研究结果表明，纯化的CD133+细胞在体外能分化为EC。在分化过程中，EPC明显失去CD133，并开始表达成熟EC特有的表面标志，如vWF。
　　 Notch信号通路是进化过程中保守的信号通路，在决定细胞命运和模型建立中起到关键的作用[3-6].胚胎发育中，Notch信号通路是神经系统，心血管系统，免疫系统，肝脏和肾脏发育中的关键信号。成年后，Noah通路涉及组织再生和干细胞功能的发挥[7-9]。
　　 β-榄香烯是从姜科植物温郁金（温莪术）的根茎中提取的抗癌有效成分，温莪术在祖国医学中有行气破血，消积止痛、抗肿瘤的功效，它在诱导肿瘤细胞凋亡、分化、抗肿瘤转移、逆转肿瘤细胞的耐药性、降低肿瘤微血管密度等诸多方面都发挥着显著的作用[10-11]。目前，临床上主要将榄香烯乳剂应用于恶性浆膜腔积液、肺癌、消化道肿瘤、脑瘤以及其他浅表性肿瘤的化疗，对白血病、恶性淋巴瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌亦有一定疗效。但其对EPC分化过程的影响尚待进一步研究。
　　 实验方法：
　　 一、大鼠骨髓来源的EPC分离、培养及鉴定
　　 应用梯度密度离心法从大鼠骨髓中分离单个核细胞，接种于内皮细胞培养液中，经血管内皮生长因子（1μg/μ1 VEGF）诱导后，进行细胞特异性标记物CD133、vWF相关抗原检测，鉴定其为内皮祖细胞。
　　 二、EPC分化过程Notch信号通路的活化情况
　　 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测不同培养时间（0天、4天、7天、10天、14天）EPC中Notch信号通路靶基因Hey-2、Hes-1的表达情况。
　　 三、β-榄香烯对EPC分化及EPC分化过程中Notch信号通路的影响
　　 （1）以不同浓度β-榄香烯（0μ9/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）干预培养4天和7天的EPC，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测EPC表面抗原CD133、vWF的表达情况。
　　 （2）以不同浓度β-榄香烯（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）干预培养7天的EPC，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测Notch信号通路中靶基因Hey-2及Hes-1的表达情况。
　　 实验结果：
　　 一、EPC的培养与鉴定
　　 原代培养24h后，细胞大部分呈小圆形；差速贴壁筛选后，培养1d可见少量细胞贴壁；4d后细胞开始伸展成梭形或纺锤形；7d有细胞集落形成，梭形细胞继续保持贴壁状态，生长旺盛；大约14d融合成内皮细胞单层典型的铺路石样形态。CD133、vWF双阳性荧光染色为正在分化的EPC。
　　 二、EPC分化过程中Notch信号通路的活化情况
　　 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测不同培养时间（0天、4天、7天、10天、14天）EPC中Notch信号通路靶基因Hey-2、Hes-1的表达情况。Hey-2、Hes-1在0天时无表达，4天有弱表达，7天、10天、14天表达逐渐增强，对灰度值的相对比值进行分析表明，p<0.05。
　　 三、β-榄香烯对EPC分化及EPC分化过程中Notch信号通路的影响
　　 1、β-榄香烯对EPC分化的影响在培养4天和7天的EPC培养液中加入不同浓度β-榄香烯（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml），作用24小时后，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测EPC表面抗原CD133和vWF的表达情况。结果表明，随着β-榄香烯浓度的增加，CD133表达逐渐增加，vWF表达逐渐减弱。对灰度值的相对比值进行分析表明，p<0.01。
　　 2、β-榄香烯对EPC分化过程中Notch信号通路的影响 在培养7天的EPC培养液中加入不同浓度β-榄香烯（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml），作用24小时后，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测Notch信号通路中靶基因Hey-2和Hes-1的表达情况。结果表明，随着β-榄香烯浓度的增加，Hey-2和Hes-1的表达逐渐减弱。对灰度值的相对比值进行分析表明，p<0.01
　　 结论：
　　 在EPC分化过程中，有Notch信号传导通路的参与。
　　 β-榄香烯对EPC的分化具有一定的抑制作用。
　　 β-榄香烯对EPC分化过程中Notch信号通路有一定的阻断作用。

目录

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结论

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