肿瘤细胞培养上清液对大鼠骨髓来源内皮祖细胞功能和活性的影响及PI3K/Akt在内皮祖细胞分化中作用的研究

摘要

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一类参与循环增殖并能分化为血管内皮细胞(endothelial cells，Ecs)，但还未能表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成微血管的前体细胞。出生后EPCs主要存在于骨髓，在某些情况下可以被动员到外周血，归巢到靶组织参与生理或(和)病理性血管生成。血管的形成主要有两种方式：即血管新生和血管生成。血管新生(angiogenesis)是指通过血管内皮细胞迁移、增殖，在原有的血管上生长出新的血管。血管生成(vasculogenesis)是指在原来没有血管系统的情况下，通过EPCs和造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)产生血流的新通道。近来的证据表明，恶性肿瘤中不仅存在血管新生，还可能存在由EPCs介导并重新形成血管的血管生成。血管生成在肿瘤生长中是不可缺少的重要环节，越来越多的研究显示EPCs在肿瘤血管生成中起重要作用。 EPCs的分化要通过复杂的信号通路调节细胞内部多种基因的表达，最终引起EPCs向成熟Ecs分化。目前对EPCs分化的研究主要从形态和细胞表面标志两方面入手。在形态上无法将EPCs与其他细胞区分开来，所以主要靠分子标志识别。AC133是新近发现的干细胞标记，不表达于成熟Ecs，认为是目前区分血管EPCs与Ecs的最主要标记。vWF(von Willebrand因子)贮存在Ecs的Weibel-Palade小体中，血浆中vWF绝大部分系由Ecs分泌，它是血管内皮的分子标志物。研究结果表明，纯化的AC133+细胞在体外能分化为Ecs。在分化过程中，EPCs明显失去AC133，并开始表达成熟Ecs特有的表面标志，如vWF。 PI3K/Akt信号通路是调节各种细胞生长、代谢、分化的重要信号通路。磷脂酰肌醇—3(羟基)激酶(Phosphatidylinositol—3(hydroxyl) kinase，PI3K)为生长因子受体超家族信号转导过程中的重要成员，可受多种细胞因子和理化因素激活。丝/苏氨酸蛋白激酶B(Ser/Thr protein kinase B，Akt)是位于P13K下游的一个重要激酶，二者均是促进细胞生存和维持细胞正常功能关键的信息分子，并且共同构成细胞应激反应过程中促进细胞生长、抑制细胞凋亡和维持细胞重要功能的信号传递链。 实验方法： 1、EPCs的分离、培养、纯化与鉴定 采用Ficoll密度梯度离心法结合差速贴壁筛选法从大鼠骨髓分离EPCs；收集培养5d的EPCs，用激光共聚焦显微镜鉴定，AC133和vWF双染阳性细胞为正在分化的EPCs。 2、EPCs增殖的检测 消化收集贴壁EPCs；以5×103/孔的细胞数接种于96孔板中，每孔体积200μl；放入37℃、5％CO2的孵育箱内培养1—2h；待细胞基本融合，加入无血清DMEM作用12h；加入不同体积分数(0％、10％、20％、40％)肿瘤细胞培养上清液；检测时，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)孵育4h，吸除孔内液体，每孔加入150μlDMSO，微量振荡器震荡10min，置酶标仪测OD490值。 3、EPCs迁移的检测 以5×104/小室的细胞数加入孔径为0.8μm的Transwell小室的上室，体积100μl，将600μl不同体积分数(0％、10％、20％、40％)肿瘤细胞培养上清液加入Transwell小室的下室；检测时，PBS冲洗3遍，用棉签擦拭膜上表面未迁移的细胞；100％甲醇固定膜下表面，苏木素染色；将膜切下，用中性树胶封固于载玻片上；在400倍光学显微镜下随机选取5个视野计数迁移的细胞数。 4、EPCs管腔形成的检测 以5×105/孔的细胞数接种于涂有Maffigel的24孔板内培养24h；加入不同体积分数(0％、10％、20％、40％)肿瘤细胞培养上清液；在100倍倒置相差显微镜下随机选取3处管腔密集的视野计数管腔数。 5、Western Blot检测EPCs分化相关蛋白表达 提取细胞蛋白质；测量待测样本A650值；蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳；免疫印迹法；蛋白印迹的分析。 6、RT-PCR检测EPCs分化相关因子mRNA表达 从互联网cDNA文库检索原始序列，参照国外文献设计，分别由大连宝生物工程有限公司和赛百盛公司合成引物；Trlzol法提取细胞总RNA；反转录反应；PCR反应。 7、检测PI3K特异性抑制剂LY294002对EPCs分化相关因子的表达 在培养3、7、10天EPCs培养液中加入PI3K特异性抑制剂LY294002(终浓度为20μmol/L)，作用12h后，用RT-PCR检测AC133、vWF mRNA的水平，用Western blot检测p—Akt表达水平，探讨P13 K/Akt信号传导通路在EPCs分化中的作用。 实验结果： 1、EPCs的培养与鉴定 原代培养24h后，细胞大部分呈小圆形；差速贴壁筛选后，培养一天可见少量细胞贴壁；3d后细胞开始伸展成梭形或纺锤形；5d有细胞集落形成；7d后梭形细胞继续保持贴壁状态，生长旺盛；大约14d融合成内皮细胞单层典型的铺路石样形态。AC133、vWF双阳性荧光染色为正在分化的EPCs。 2、肿瘤细胞培养上清液对EPCs增殖的影响 用不同体积分数肿瘤细胞培养上清液作用于EPCs，当上清液体积分数达40％时，促进作用最强(P<0.01)。在0-48h期间，随时间延长，肿瘤细胞培养上清液促进EPCs增殖的作用相应增强，并具有剂量时间依赖性。 3、肿瘤细胞培养上清液对EPCs迁移的影响 肿瘤细胞培养上清液可提高EPCs的迁移能力，6h开始明显增强(P<0.01)，于24h达高峰(p<0.01)，48h有所下降，但仍明显高于对照组(P<0.01)。在体积分数为40％时最为显著。 4、肿瘤细胞培养上清液对EPCs管腔形成的影响 肿瘤细胞培养上清液显著增强EPCs体外管腔形成能力，在体积分数为40％时最为显著(p<0.01)，并且形成的管腔样结构也较对照组复杂。 5、EPCs分化过程中AC133、vWF、PI3K、Akt蛋白表达的变化 用Western blot法分别检测培养0、3、7、10、14天EPCs在分化过程中AC133、vWF、PI3K、Akt蛋白的表达水平。AC133在0天表达最强，3天有弱表达，7天、10天、14天几乎没有表达，对光密度值的相对比值进行分析表明，P<0.05。vWF在培养过程中表达强度没有明显变化(P>0.05)。PI3K和Akt在0天表达最强，3天表达稍弱，以后随着培养时间的延长，表达逐渐减弱(P<0.05)。 6、EPCs分化过程中AC133、vWF、PI3K、Akt mRNA水平的变化 用RT-PCR法检测EPCs培养0、3、7、10、14天AC133、vWF、P13K、Akt mRNA的表达情况。AC133在0天表达最强，3天有弱表达，7天、10天、14天几乎没有表达，对光密度值的相对比值进行分析表明，P<0.05。vWF在培养过程中表达强度没有明显变化(P>0.05)。PI3K和Akt在0天表达最强，3天表达稍弱，以后随着培养时间的延长，表达逐渐减弱(P<0.05)。 7、加入PI3K特异性抑制剂LY294002后，EPCs相关因子的表达 在培养3、7、10天EPCs培养液中加入PI3K特异性抑制剂LY294002(终浓度为20μmol/L)，作用12h后，分别用RT-PCR检测AC133、vWF mRNA表达，用Western blot法检测p—Akt蛋白表达。结果表明，EPCs培养7天和10天时AC133mRNA表达水平低于培养3天的水平(P<0.05)；vWF的表达水平没有明显变化(P>0.05)；p—Akt蛋白表达逐渐下降，10天与3天相比P<0.05。 结论： 1、肿瘤细胞培养上清液能够促进EPCs的增殖、迁移和管腔形成。 2、EPCs的增殖、迁移及管腔形成能力与肿瘤细胞培养上清液的体积分数及作用时间有关，在上清液体积分数为40％、作用时间为24h时，差异最显著。 3、Ficoll密度梯度离心法结合差速贴壁筛选法可以分离大鼠骨髓的EPCs，获得EPCs纯度和存活率较高。 4、在EPCs分化为Ecs的过程中，可能有PI3K/Akt信号传导通路的参与。 5、加入抑制剂LY294002后，EPCs分化相关因子表达变化，推测PI3K/Akt信号传导通路可能与EPCs分化有关。此结果可为肿瘤的抗血管生成治疗提供一种途径或思路。

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论文一 肿瘤细胞培养上清液对大鼠骨髓来源内皮祖细胞功能和活性的影响

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材料与方法

实验结果

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结论

论文二PI3K/Akt信号传导通路在大鼠骨髓来源内皮细胞分化中作用的研究

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综述 内皮祖细胞与肿瘤血管形成的研究进展

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