淫羊藿苷在促大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化过程中对Notch信号通路Notch1、CBF1蛋白表达的影响

摘要

目的:观察淫羊藿苷(ICA)促离体培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖、骨向分化能力,研究ICA在促大鼠MSCs骨向分化过程中对Notch信号通路Notch1、CBF1蛋白表达的影响.方法:MTT检测ICA对MSCs增殖能力的影响;pNPP和ELISA检测ICA对MSCs碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)和骨钙素(BGP)合成分泌的影响,实验中采用10-8M雌二醇(E2)作为阳性对照.观察正常及加入10μMγ分泌酶抑制剂(DAPT)的情况下,各组碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、骨钙素(BGP)等骨向分化指标的差异.Western blotting检测各组Notch1、CBF1蛋白的表达水平.结果:1、流式细胞仪检测分离到的大鼠MSCs表面标志抗原CD29表达阳性,CD45及CD34表达阴性;倒置相差显微镜、扫描电子显微镜观察细胞形态,均符合MSCs的生物学特性.2、经MTT法检测ICA在10-4M～10-8M浓度范围内促MSCs增殖作用,发现10-5M ICA组的OD值较其它组明显提高(P＜0.05),并能显著提高MSCsALP的表达(P＜0.05).根据上述实验结果选取10-6M、3×10-6M、10-5M进一步筛选ICA最佳促骨向分化浓度,结果表明,3×10-6M ICA能显著提高MSCs ALP、Col I和BGP的表达(P＜0.05),后续实验选取3×10-6M ICA作为干预浓度.3、实验观察了3×10-6M ICA对低、中、高密度MSCs ALP表达的差异,实验结果表明低密度MSCs较中、高密度MSCs ALP表达量明显提高(P＜0.05),间接说明了需要相邻细胞间配体与受体相互作用激活的Notch信号通路可能发挥抑制成骨分化作用.4、ICA能够下调Notch信号转录因子CBF1蛋白的表达(P＜0.05),但对Notch1蛋白的表达不起作用(P＞0.05).5、DAPT能够下调CBF1、Notch1蛋白的表达(P＜0.05).6、ICA与DAPT联合作用能够下调CBF1、Notch1的表达(P＜0.05).结论:ICA能够促进MSCs骨向分化,能通过下调Notch信号核心结合蛋白CBF1的表达抑制Notch信号通路.Notch信号通路在ICA促MSCs向OB分化过程中发挥抑制成骨作用.ICA与DAPT相互作用可激活Notch1的表达。