多西他赛节律化疗及EGCG抑制胃癌生长及抗血管生成的实验研究

摘要

目的：在细胞毒性水平上最大耐受剂量(maximum tolerable dose,MTD)进行化疗是治疗进展期胃癌的主要方法,然而其毒副反应和耐药性严重影响了治疗效果。为与常规化疗相区别,2000年Hanahan D首次提出节律性化疗的概念,也就是持续低剂量化疗(continuous low-dose chemotherapy,LDM),这种小剂量、高频率化疗的方法,增加了对肿瘤微血管的靶向治疗效果,毒副反应小,且不易产生耐药。多西他赛为紫杉类抗肿瘤药物,有实验报道其具有显著的抗血管生成作用,以多西他赛为基础的化疗方案是近20年来胃癌治疗的重要进展之一。
　　 节律化疗与其它抗血管生成药物合用时抗肿瘤效果明显提高,但目前所发现的血管抑制剂多为基因重组表达的蛋白制剂,面临着用药剂量大、提取困难、微生物的浸入、价格昂贵及患者需长期坚持服用等方面的困扰,在临床应用中受到一定的制约。最新研究显示绿茶及其最主要的活性成分表没食子几茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG]具有抗血管生成作用。因此,本实验拟探讨节律多西他赛和血管形成抑制剂EGCG对胃癌生长及肿瘤血管生成的抑制作用,并探讨二者联合应用对胃癌的治疗价值。
　　 材料与方法：
　　 1、采用低剂量的多西他赛,持续作用于人脐静脉内皮细胞株(human umbilicalvein endothelial cells,HUVEC)和人BGC-823胃癌细胞株144 h,MTT法观察细胞增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡和实时定量PCR测定删VEC及BGC-823细胞血小板反应素1(thrombostondin-1,TSP-1)Mrna的表达水平。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各条件培养液中TSP-1的蛋白分泌。
　　 2、MTT法测定EGCG对BGC-823细胞及HUVEC细胞增殖的影响取人胃癌细胞株BGC823细胞及HUVEC细胞,分别加入到96孔细胞培养板中,实验组加入不同浓度的EGCG,使其终浓度分别为5,10,20,40,80μmol/L,对照组则加等量不含药物的培养液。48 h、96 h和144 h后,MTT法检测各孔吸光度值(OD值),计算细胞生长抑制率。
　　 3、MTT法测定多西他赛与EGCG联合用药对BGC-823细胞及HUVEC细胞增殖抑制效应的协同性观察取对数生长期的BGC-823细胞及HUVEC细胞分别加入到96孔细胞培养板中过夜培养,次日分别加入多西他赛(终浓度分别为0.001,0.01,0.1,1 nmol/L),EGCG20μmol/L,EGCG20μmol/L与多西他赛(终浓度为0.001,0.01,0.1,1 nmol/L)混合液,144 h后MTT法检测各孔吸光度值(OD值),计算细胞生长抑制率。计算Q值,并判断两药的联合效应。
　　 4、建立荷人BGC-823胃癌细胞裸鼠移植瘤模型,将荷瘤小鼠随机分成5组,对照组、MTD组、LDM组、EGCG组及联合组,分别给予0.9％氯化钠溶液、最大耐受剂量多西他赛、低剂量多西他赛、EGCG及低剂量多西他赛联合EGCG腹腔注射,观察肿瘤生长情况,小鼠体重和外周血白细胞数。免疫组化染色,测定CD31和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达情况。
　　 5、统计学方法结果数据以x-±s表示,采用SPSS17.0软件进行统计学处理,采用单因素方差分析和Pearson相关分析。检验水准α=0.05。
　　 结果：
　　 1、多西他赛对人HUVEC的抑制作用强于对BGC-823胃癌细胞的抑制作用,计算的IC50值分别为0.06±0.005 nmol/L和1.1±0.024 nmol/L。较低IC50浓度的多西他赛作用于HUVEC引起细胞凋亡的百分比近似于较高IC50浓度的多西他赛作用于BGC-823细胞的百分比。多西他赛明显地增加了人HUVEC的TSP-1表达(为对照组的1.78±0.18倍),而且明显地增加了TSP-1蛋白的分泌,与对照组的100％相比,多西他赛组为806±73％(P＜0.05),而肿瘤细胞的TSP-1表达和分泌没有增加。
　　 2、EGCG对人胃癌BGC-823细胞的增殖有显著抑制作用,呈时间、剂量依赖性,随着浓度的增加,时间的延长其抑制作用增强(P＜0.05)。同一时间,BGC-823细胞增殖抑制率与EGCG浓度呈正相关;同一浓度,BGC-823细胞增殖抑制率与作用时间呈正相关。
　　 较小剂量(5μmol/L和10μmol/L)EGCG作用于HUVEC细胞时,无明显抑制作用;20μmol/L EGCG在48 h治疗后明显抑制了HUVEC细胞的生长;然而当剂量大于20μmol/L(40μmol/L和80μmol/L)时完全阻止了HUVEC细胞的生长。
　　 3、EGCG与各种浓度的多西他赛联用均可明显抑制人胃癌BGC-823细胞增殖,差异有统计学意义(P＜0.05),二者有明显的协同作用,Q值均大于1.15。EGCG与各种浓度的多西他赛联用均可明显抑制HUVEC细胞增殖,差异有统计学意义(P＜0.05),EGCG与较低浓度(0.001,0.01,0.1 nmol/L)的多西他赛联用有明显的协同作用,Q值均大于1.15,EGCG与较高浓度(1 nmol/L)的多西他赛联用,Q值为1.07,二者具有相加作用。
　　 4、对照组肿瘤生长迅速,其他治疗组肿瘤生长都受到了抑制,其中联合治疗组抑瘤效果最显著,与单药组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。LDM组、EGCG组及联合组与对照组相比,无明显的毒副作用,而MTD组小鼠体重和白细胞计数明显下降。对照组肿瘤组织的MVD及VEGF的表达水平最高,与对照组比较,各治疗组肿瘤组织微血管密度(microvessel density,MVD)及VEGF的表达均下降,差异有显著性(P＜0.05);与MTD组比较,LDM组和EGCG组肿瘤组织MVD表达也下降(P＜0.05);与单药组比较,联合组MVD及VEGF表达下降更多(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1、多西他赛节律化疗优先抑制了内皮细胞的增殖和诱导内皮细胞的凋亡,其机制可能是由于多西他赛节律化疗增加了内皮细胞TSP-1的表达和分泌；
　　 2、EGCG能够抑制胃癌BGC-823细胞的增殖,呈时间、剂量依赖性,与多西他赛联合有协同作用。EGCG与多西他赛联合对HUVEC细胞的生长抑制有协同或相加作用；
　　 3、多西他赛节律化疗能够有效抑制裸鼠胃癌移植瘤的生长及微血管的形成,与MTD组相比,抑瘤效果显著且持久,而且无明显的毒副作用,与EGCG联合应用时效果增强,且毒副作用没有增加。