溴氯哌喹酮干预对NOD.H-2h4小鼠自身免疫甲状腺炎发病的影响及机制研究

摘要

目的：自身免疫性甲状腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT)是典型的器官特异性自身免疫性疾病,发病机制与细胞免疫和体液免疫异常均相关。研究证实,AIT是由CD4+T细胞介导发生,并以甲状腺内淋巴细胞浸润和血清中存在甲状腺特异性自身抗体为特征。调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)为一类近年来新发现的CD4+T细胞亚群,主要在机体免疫系统中发挥负向调节作用,既能抑制不恰当的免疫反应,又能限定免疫应答的范围、程度及作用时间,抑制效应细胞的增殖及免疫活性。近年来,CD4+CD25+调节性T细胞在多种自身免疫性疾病中的作用日益引起人们的关注,动物实验和临床研究发现CD4+CD25+调节性T细胞数目和功能的异常与多种自身免疫性疾病关系密切。最近研究还发现,一群不同于Th1、Th2、Treg的细胞亚群,它们不表达IL-4或IFN-γ,却高水平分泌IL-17,被命名为Th17细胞。Th17细胞在多种自身免疫性疾病中发挥致病性作用。研究Th17细胞的功能、分化机制,以及与其他T细胞亚群之间的关系,对于深入认识机体免疫调节规律,理解疾病发病机制,寻求更有效的疾病干预靶点具有非常重要的意义。溴氯哌喹酮(Halofuginone,HF)是从传统中药光绣球根部分离出来的小分子复合物,以前作为抗疟药使用,最近美国研究者发现了HF新的作用,研究认为HF可以抑制Th17细胞的分化,而不改变其他正常免疫细胞,减轻自身免疫反应。新近研究发现还存在一种新的B细胞亚群——调节性B细胞(Regulatory B cell,Breg),其与B细胞在自身免疫性疾病中扮演致病性角色的传统观点不同。Breg通过与其它细胞(如T细胞)相互作用及分泌细胞因子或抗体等多种机制介导免疫耐受、抑制炎症反应,发挥免疫调节作用。Breg在一些自身免疫病小鼠模型的发生发展和转归中起重要的调节作用.本研究通过高碘诱发NOD.H-2h4小鼠发生自发性自身免疫性甲状腺炎(Spontaneous autoimmune thyroiditis,SAT),观察此动物模型中CD4+CD25+调节性T细胞、Th17细胞、调节性B细胞的变化,并对其进行HF治疗,观察HF干预对CD4+CD25+调节性T细胞、Th17细胞、调节性B细胞的影响,探讨碘致AIT以及HF干预治疗AIT的免疫机制。
　　 方法：选取4周龄NOD.H-2h4雌鼠30只,体重20克左右,随机分为对照组(给予无菌双蒸水)和高碘饮水组(给予含0.005％碘化钠水,相当于小鼠正常碘摄入量的100倍),每组动物分别于实验开始后8周麻醉处死。留取各组NOD.H-2h4小鼠甲状腺,HE染色观察淋巴细胞浸润情况并进行甲状腺炎症程度评分；酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组小鼠血清甲状腺球蛋白抗体(TgAb)水平；制备各组NOD.H-2h4小鼠脾脏单个核细胞悬液,免疫荧光染色流式细胞仪分析CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞、Th17细胞及调节性B细胞比例的变化;提取小鼠脾细胞总RNA,实时定量RT-PCR检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞特异性转录因子Foxp3 mRNA表达水平；Th17细胞分泌的细胞因子IL-17mRNA,特异性转录因子RORγtmRNA表达水平；Breg细胞分泌的细胞因子IL-10mRNA表达水平。在以上实验的基础上,另外选择4周龄NOD.H-2h4小鼠,随机分为对照组、SAT非HF治疗组以及SAT给予HF治疗组,每组15只动物。对照组喂以无菌双蒸水:SAT非HF治疗组小鼠饲以含0.005％碘化钠(碘化钠浓度为50mg/L)的无菌双蒸水同时每天注射DMSO(2μg/ml/只)；HF治疗组在给予含0.005％碘化钠的无菌双蒸水,同时每天注射HF(2μg/ml/只)。所有动物在实验给药8周后麻醉处死。同样留取各组。NOD.H-2h4小鼠甲状腺、血清、脾脏等进行上述指标的检测。应用SPSS17.0软件处理和分析数据。
　　 结果：NOD.H-2h4小鼠高碘饮水8周后甲状腺炎的发生率明显高于饮用无菌双蒸水的对照组,甲状腺组织有不同程度的淋巴细胞浸润,甲状腺相对重量及血清TgAb水平均较对照组小鼠明显升高(P＜0.05)。发生SAT的NOD.H-2h4小鼠脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞所占比例和Foxp3 mRNA表达量均较对照组明显降低(P＜0.01)；脾细胞中调节性B细胞所占比例和IL-10mRNA表达量均较对照组明显降低(P＜0.05)；脾细胞中Th17细胞所占比例和IL-17 mRNA表达量,RORγtmRNA表达水平均较对照组明显升高(P＜0.05)。与SAT非HF治疗组相比,HF治疗组NOD.H-2h4小鼠CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的比例和Foxp3mRNA表达量均无明显变化(P＞0.05)；但脾细胞中Th17细胞比例及其转录因子IL-17mRNA,RORγtmRNA表达水平均明显减低(P＜0.01)；脾细胞中Breg细胞比例及其转录因子IL-10mRNA表达水平均明显升高(P＜0.05)。同时,HF治疗组NOD.H-2h4小鼠血清TgAb滴度以及甲状腺内淋巴细胞浸润程度均较同周龄SAT非HF治疗组小鼠明显降低(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1、NOD.H-2h4小鼠在高碘诱导发生甲状腺炎时脾脏CIM+CD25+调节性T细胞、调节性B细胞比例明显降低,Th17细胞比例明显升高,提示CD4+CD25+调节性T细胞,Th17细胞,调节性B细胞可能参与该小鼠自身免疫性甲状腺炎的发生发展。
　　 2、高碘诱导的NOD.H-2h4甲状腺炎小鼠给予HF治疗后,甲状腺炎症程度及血清甲状腺特异性抗体滴度均明显降低,同时,脾细胞中Th17细胞比例及其分泌的细胞因子IL-17mRNA,转录因子RORγtmRNA表达水平均明显减低;脾细胞中Breg细胞比例及其分泌的细胞因子IL-10mRNA表达水平均明显升高。提示HF干预可能通过影响NOD.H-2h4小鼠Th17细胞,Breg细胞水平发挥治疗AIT的作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语

论文一 碘诱发NOD.H-2M小鼠AIT模型CD4+CD25+调节性T细胞、Th17及调节性B细胞变化的实验研究

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

论文二 溴氯哌喹酮干预对碘诱导的NOD.H-2h4小鼠自身免疫甲状腺炎发病影响的实验研究

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

本研究创新自我评价

综述:T细胞在自身免疫性甲状腺疾病中的作用

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