硒干预NOD.H-2h4小鼠SAT影响的实验研究及自身免疫甲状腺炎患者硒治疗效果的遗传背景分析

摘要

硒元素(selenium，Se)是人体必须的微量元素之一，像元素碘一样硒也参与了甲状腺激素的合成、活化和代谢过程。最近的一些临床研究发现硒补充治疗可以降低自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)患者血清甲状腺特异性自身抗体的滴度，但是具体的作用机制尚未阐明。除了血硒浓度增加和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)活性增强，没有关于甲状腺中硒蛋白表达的资料。硒的这种保护作用在产后甲状腺炎和亚急性甲状腺炎已得到证实，硒的作用是否通过改变甲状腺细胞、间质、内皮细胞或甲状腺内浸润的免疫细胞中的硒蛋白的表达来实现，目前仍不确定。
　　 本研究对AIT的动物模型-NOD.H-2h4小鼠实施硒干预治疗，观察硒对自发性自身免疫性甲状腺炎(spontaneous autoimmune thyroiditis，SAT)炎症反应的影响以及抗体水平的变化，并从氧化-抗氧化角度探讨其作用机制，为临床干预治疗提供实验依据。
　　 方法：选择4周龄NOD.H-2h4小鼠，随机分为对照组(Control)、甲炎组(SAT)以及甲炎补硒组(SAT+Se)。对照组喂以普通无菌水；甲炎组小鼠饲以含0.005％碘化钠(碘化钠浓度为50mg/L)的无菌水8周诱导发生SAT；造模成功后硒治疗组小鼠分别给予含0.3 mg/L，0.5 mg/L亚硒酸钠的无菌水，于给硒8周，12周及16周时麻醉处死各组动物。留取小鼠甲状腺组织HE染色观察淋巴细胞浸润情况；透射电镜观察甲状腺细胞超微结构；ELISA法测定血清甲状腺球蛋白(TgAb)水平；电感耦合等离子体质谱仪检测血清硒水平；免疫组化染色观察4-羟基壬烯醛(4-HNE)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)、过氧化物氧化还原蛋白(PRDX5)、硫氧还蛋白还原酶-1(TrxR-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx1)表达变化；Western blot分析PRDX5、TrxR-1、GPx1蛋白水平变化。
　　 应用SPSS16.0软件处理和分析数据。参数计量资料：以mean±SD表示，两组比较采用独立样本t检验，方差齐同的多组比较采用单因素方差分析(ANOVA)，方差不齐时使用非参数检验。计数资料：用率表示，率的比较采用卡方检验，分别选用Pearson卡方、连续性校正卡方或Fisher's确切概率法。P<0.05判定为具有显著性差异。
　　 结果：
　　 1、补硒后，甲炎补硒组NOD.H-2h4小鼠血硒浓度明显升高，在补硒各时点均显著高于甲炎组及对照组(P<0.05)；甲炎组血清硒水平与同时点对照组相比下降(16w，P<0.05)。
　　 2、与同周龄对照组小鼠比较，甲炎组小鼠甲状腺相对重量明显增加(P<0.05)；甲炎补硒组小鼠甲状腺相对重量较同周龄甲炎组小鼠明显降低(P<0.05)。
　　 3、与同周龄对照组小鼠比较，甲炎组血清TgAb滴度显著升高(P<0.05)；甲炎补硒组可见：补硒一组在补硒8周、12周、16周后血清TgAb滴度显著下降，与同时点甲炎组相比均有显著差异(8w，P=0.000；12w，P=0.009；16w，P=0.037)；与同时点对照组相比较无明显差异。补硒二组血清TgAb滴度下降不明显，与同时点甲炎组相比较无显著差异。
　　 4、补硒后，甲炎补硒组NOD.H-2h4小鼠SAT发生率下降，甲炎补硒一组淋巴细胞浸润程度较甲炎组明显减轻，透射电镜观察到甲状腺细胞超微结构有所恢复。
　　 5、甲状腺石蜡切片免疫组化染色分析可见甲炎补硒一组甲状腺内抗氧化酶PRDX5、TrxR1、GPx1表达较甲炎组增强，而氧化损伤产物4-HNE及8-OHdG较甲炎组相比下降。
　　 6、Western blot分析可见补硒一组甲状腺内抗氧化酶PRDX5、TrxR1、GPx1表达较甲炎组增强。
　　 结论：
　　 1、补硒可以减轻NOD.H-2h4小鼠碘致甲状腺肿。
　　 2、补硒后NOD.H-2h4小鼠自身免疫甲状腺炎发病率和炎症程度均下降，同时血清TgAb水平降低。
　　 3、补硒后NOD.H-2h4小鼠血硒水平升高，甲状腺内硒蛋白及抗氧化酶蛋白含量增加。提示补硒可能通过提高甲状腺内硒含量及硒蛋白活性发挥氧化防御的作用，减轻甲状腺自身免疫炎症反应。
　　 目的：自身免疫甲状腺炎(Autoimmune Thyroiditis，AIT)是内分泌系统的常见病，本病特征性的改变是甲状腺内有大量的淋巴细胞浸润，血清甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)和/或甲状腺球蛋白抗体(TgAb)水平升高，甲状腺功能可以表现为正常、亚临床甲减和临床甲减。目前对AIT尚无任何确切有效的治疗方法。近期国内外临床干预研究发现补硒可以降低AIT患者TPOAb滴度，本课题组也进行了硒干预治疗AIT的前瞻性对照双盲研究，发现硒干预可以降低TPOAb滴度，但并不是所有补硒患者TPOAb均下降，且不同个体TPOAb滴度下降程度不同，这一现象可能与遗传因素有关。众所周知硒通过硒蛋白发挥生物学作用，而研究发现硒蛋白P基因上的SNP r25191g/a及GPx4基因上的SNP GPX4c718t能够影响硒的状态及硒蛋白的代谢。因此本研究选取以上两种SNPs，通过观察SNPs不同基因型患者补硒前后硒状态，血清GPx3活性及TPOAb滴度的相应变化，来判断是否遗传因素在硒干预治疗AIT患者TPOAb滴度下降过程中起重要作用。
　　 方法：研究对象来自于医大一院就诊患者。每例患者入组前进行甲状腺功能及甲状腺自身抗体检测，并进行调查问卷采集病史，符合AIT入组标准者均签署知情同意书，纳入队列中。我们共收集病例97名，采集空腹血液标本，空腹静脉抗凝血用于基因组DNA提取及SNP分型，空腹静脉促凝血用于血清甲状腺功能(TSH、FT4)、自身抗体(TPOAb)、血硒浓度及血清GPx3活性测定。对所有入组成员进行硒干预，给予硒酵母200μg/d，观察6个月，于给药后第3，6月进行随访，留取血液标本进行以上各项指标的检测。
　　 将所有数据输入SPSS16.0。正态分布的计量资料：年龄、血硒浓度、GPx3活性以mean±SE表示，补硒前后比较采用配对t检验；方差齐同的多组比较采用单因素方差分析(ANOVA)。偏态分布的计量资料：TPOAb以中位数表示，转换为对数形式后成正态分布，再行统计分析。计数资料：用率表示，组间下降率的比较采用Mann-Whitney秩和检验；其他率的比较采用卡方检验，分别选用Pearson卡方、连续性校正卡方或Fisher's确切概率法。P<0.05判定为具有显著性差异。
　　 结果：
　　 1、SNP r25191g/a不同基因型患者补硒后TPOAb滴度下降不同，GA基因型患者TPOAb滴度在补硒后3月和6月均显著低于补硒前(3月，P=0.015；6月，P=0.021)，与补硒前相比下降率分别为19％和20％；AA基因型患者TPOAb滴度在补硒3月下降明显(3月，P=0.001)，下降了49％；GG基因型患者TPOAb滴度虽呈逐渐下降趋势，但与补硒前相比较无显著差异。对不同基因型患者TPOAb下降率进行比较，可见补硒3月时，AA基因型患者TPOAb滴度下降率显著高于GA及GG型(与GA比，P=0.039；与GG比，P=0.016)。不同基因型患者补硒后血硒浓度及血清GPx3活性均显著增加：AA基因型患者血硒浓度高于其他基因型；补硒3个月时GG基因型患者血清GPx3活性显著高于GA基因型患者(P=0.026)，而AA基因型患者血清GPx3活性均高于其他基因型患者。
　　 2、SNP GPx4c718t不同基因型患者补硒后TPOAb滴度下降程度不同，CC型及CT型患者TPOAb滴度在补硒3月下降明显(CC，P=0.006；CT，P=0.013)，下降率分别为26.5％和6.5％；TT型患者TPOAb滴度在6月显著低于补硒前(P=0.027)，下降率为20.0％。对不同基因型患者进行比较，可见补硒3月至补硒6月间，TT基因型患者TPOAb滴度下降率显著高于CC型(P=0.044)。补硒后SNP GPX4c718t不同基因型患者血硒浓度及血清GPx3活性均显著增加，TT型患者血硒浓度明显高于其他基因型。(补硒3月，与CT型相比P=0.002；与CC型相比P=0.001，补硒6月，与CC型相比P=0.019)；并未发现SNP GPX4c718t基因型对血清GPx3活性产生影响，但可以看到补硒后TT型患者血清GPx3活性高于其他基因型患者。
　　 结论：
　　 1、硒干预治疗能够显著降低自身免疫甲状腺炎患者TPOAb滴度，表明硒对AIT患者有治疗作用。
　　 2、SNP r25191g/a不同基因型患者补硒后，血硒浓度、血清GPx3活性及TPOAb滴度变化程度不同。AA基因型患者血硒浓度及血清GPx3活性均高于其他基因型同时TPOAb的滴度下降最明显，证实SNP r25191g/a能够影响硒状态及硒蛋白代谢，而AA基因型对补硒治疗反应性最为敏感，TPOAb降低效果最好。
　　 3、SNP GPX4c718t不同基因型患者补硒后，血硒浓度及血清GPx3活性在TT基因型患者中均高于其他基因型，同时TT基因型型患者TPOAb滴度在补硒6月时下降最明显，证实SNP GPX4c718t能够影响硒状态及硒蛋白代谢，而TT基因型对补硒治疗反应性最为敏感，TPOAb降低效果最好。