抵制PI3K/AKT/mTOR信号通路降低白血病细胞株PHLPP蛋白的表达

摘要

前言
　　 急性髓系白血病(AML)是一种骨髓造血干/祖细胞高度异质性克隆性疾病,其特点是未成熟粒细胞的增殖失控。调节失常的细胞信号通路与功能失调的转录因子起协同作用,促进造血祖细胞向白血病转化。PI3K/Akt/mTOR信号通路的异常活化通常被认为在白血病的发生、发展以及耐药中起关键作用。国内外大量研究均表明使用激酶抑制剂下调该异常激活的信号通路活性可以抑制白血病细胞增殖并诱导其凋亡,但单激酶抑制剂效果欠理想。
　　 该通路的异常活化机制与Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)受体或c-Kit酪氨酸激酶受体的突变激活、N-Ras或K-Ras突变等因素有关。在慢性粒细胞白血病中与JAK介导的BCR-ABL融合基因突变有关。另外与调节该通路的几种磷酸酶表达失常或功能异常有关,这其中包括蛋白磷酸酶PP2A、PTEN和PHLPP。PP2A及PTEN在白血病中的研究较多,PHLPP近年来在实体瘤中研究相对较多,在白血病中的研究少见。PHLPP是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,通过使Akt的Thr308和Ser473位点去磷酸化而终止其下游信号传导。PHLPP相对应的基因在许多实体瘤内如结肠癌、乳腺癌中经常缺失,PHLPP的缺失导致细胞中的Akt持续磷酸化,进而导致肿瘤的发生发展。有研究表明恢复结肠癌细胞PHLPP的表达可抑制结肠癌细胞的异常增殖。但PHLPP在白血病患者及白血病细胞株中的表达如何以及在下调PI3K/Akt/mTOR通路活性抑制白血病细胞增殖的过程中PHLPP蛋白表达的变化情况尚不明确。
　　 目的
　　 研究PHLPP蛋白在白血病细胞株K562、U937及HL60中的表达情况并观察抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路活性对PHLPP表达的影响,进而探讨PHLPP的表达调控机制。
　　 材料与方法
　　 急性髓系白血病细胞株K562、HL60及U937由我院血液室常规保存,AG490购自碧云天生物技术有限公司,wortmannin及rapamiycin均购自美国Merck公司,兔抗人PHLPP抗体购自abcam公司,兔抗人p-Akt1/2/3(Ser473)、Akt1/2/3(H136)抗体购自Santa cruz公司。白血病细胞株均培养于10%新生牛血清的RPMI1640培养液中,37℃,5%CO2饱和湿度细胞培养箱内,1-2天传代一次。取对数生长期细胞实验,Western blot检测三种白血病细胞株中PHLPP蛋白的表达情况后,以K562及HL60为主要研究对象,分别使用不同浓度的AG490、wortmannin或rapamycin作用于K562或HL60细胞,一定时间后WST-1法检测细胞的增殖活性,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞的凋亡情况,Western blot检测PHLPP和/或p-Akt、Akt蛋白表达水平的变化。
　　 结果
　　 1、PHLPP蛋白在K562及HL60细胞中表达,在U937细胞中不表达。
　　 2、AG490及wortmannin均以时间以及剂量依赖性方式抑制K562和/或HL60细胞增殖。
　　 3、AG490及wortmannin均呈时间依赖性方式诱导K562和/或HL60细胞凋亡。
　　 4、AG490及wortmannin均呈时间依赖方式降低K562和/或HL60细胞PHLPP、P-Akt蛋白的表达,但是对总Akt的水平无明显影响。
　　 5、Rapamycin也呈时问依赖方式降低K562及HL60细胞PHLPP蛋白的表达。
　　 结论
　　 1、U937细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路的异常活化可能与其PHLPP蛋白的表达缺失有关。
　　 2、PI3K/Akt/mTOR信号通路在白血病细胞株中可能存在与PHLPP相关反馈抑制通路。