急性髓系白血病初诊患者组织蛋白酶B、L及血管内皮生长因子mRNA表达及意义

摘要

目的
　　 采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测CTSB、CTSL及VEGFmRNA的相对表达水平,分析三者在AML初诊患者中及良性血液病患者中的表达变化及相关性。
　　 方法
　　 一、选取研究对象
　　 收集中国医科大学附属盛京医院血液病治疗中心2009年1月-2011年1月住院及门诊的AML患者41例,其中M11例,M210例,M310例,M49例,M59例,M62例,非恶性血液病患者25例做为对照组。所有病例经细胞形态学、细胞化学染色、流式细胞术免疫分型及PCR融合基因检测确诊为AML(FAB)。
　　 二、实时荧光定量PCR
　　 收集患者骨髓单个核细胞,提取总RNA,按试剂盒说明书配置逆转录反应体系合成cDNA,引物由Takara公司设计合成,采用SYBR Green I实时定量荧光PCR方法,以β-actin为内参照,进行SYRB Green I实时荧光定量PCR,检测CTSL、CTSB及VEGF的表达水平。
　　 三、结果判断
　　 将标准品cDNA10倍浓度梯度稀释为5-6个浓度梯度,各取2μl作为模板进行Real Time PCR反应,由各扩增曲线得到的Ct值制作标准曲线,从而得到样本的拷贝数。以β-actin作为内参照,CTSL、CTSB及VEGF作为目的基因,通过目的基因和内参基因拷贝数的比值进行样本间相对定量的比较。
　　 四、统计学分析
　　 采用SPSS17.0统计软件包中Mann-Whitney检验,相关分析采用Spearman相关检验,P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果
　　 一、方法的可靠性和准确性
　　 1、RNA的纯度和质量分析
　　 所提取的总RNA经紫外分光光度计检测,比值在1.8-2.0之间,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,条带清晰可见,无明显降解。
　　 2、扩增的特异性及定量的准确性
　　 标准品cDNA经梯度稀释后进行PCR反应,制作标准曲线。得到的标准曲线相关系数(r2)均＞0.998,斜率在-3.3至-3.5之间,反映定量准确,扩增效率良好。扩增后溶解曲线显示锐利的单一锋,无其他非特异性锋,说明扩增产物均一,无非特异扩增及引物二聚体。琼脂糖凝胶电泳进一步验证扩增片段的均一性及长度。
　　 二、CTSB、CTSL、VEGF的表达
　　 AML骨髓单个核细胞(BMMNC)中CTSB、CTSL mRNA的表达水平均明显高于良性血液病患者(P＜0.05)。在AML中存在VEGFmRNA的过度表达,其表达水平明显高于良性血液病组(P＜0.05)。在AML中,CTSB、CTSL与VEGF三者间的mRNA的表达相互间存在显著正相关性。在初诊的AML组中CTSB、CTSL及VEGF高表达与AML缓解率及髓外浸润相关。
　　 结论
　　 本研究表明VEGF、组织蛋白酶B、L在骨髓细胞中的表达水平与AML的发生发展及髓外浸润密切相关,同时三者在此过程中还可能相互调控,共同完成侵袭转移的过程。随着对组织蛋白酶的作用和调控机制的深入研究和分子生物学技术的飞速发展,组织蛋白酶B、L可望成为急性髓系白血病基因治疗的新靶点和辅助诊断标准。