计算机辅助超声量化分析技术在大鼠脂肪肝模型中应用的初步研究

摘要

近年来,随着人们生活水平的不断提高,脂肪肝(fatty liver diseaseFL)的发病率不断上升,已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病[1-2]。脂肪肝早期是防治的最佳阶段,因此脂肪肝的及早发现、及早治疗,能有效防止患者向肝硬化和肝功能衰竭发展,无疑可以减轻病患的痛苦和负担,在临床上有重大意义。
　　 超声检查以其无创性、经济性而成为诊断脂肪肝的首选方法,但由于受到患者条件、检查者经验及仪器条件等诸多影响,诊断结果相对客观性较差,且在分级诊断方面缺乏量化数值指标。我们通过四氯化碳和高脂饮食诱导建立了大鼠脂肪肝模型,利用计算机上的ImageJ软件对大鼠的肝脏、肾脏超声图像特定区域的Mean值进行分析,探讨计算机辅助超声量化分析技术对大鼠脂肪肝诊断的准确性及分级诊断的可能性。
　　 目的：
　　 评价计算机辅助超声量化分析技术在脂肪肝诊断及分级诊断方面的价值。
　　 方法：
　　 1、实验动物及主要实验试剂
　　 清洁级健康雄性SD大鼠40只,雄性,6-12周龄,每只体重175±25g;8%硫化钠,10%水合氯醛:10%甲醛;高脂饲料配方:基础饲料87.9%,猪油10%(自制),胆固醇2%,猪胆盐0.1%;按容积比与大豆油配制成40%CCl4稀释液;化学试剂均由国药集团提供。
　　 2、超声仪器及软件
　　 PHILIPiU22,L12-5线阵探头,Microsoft Office Excel2003,Image-ProPlus6.0,ImageJ软件,软件来自于rsb.info.nih.gov/ij/index.html。
　　 3、实验分组及模型制备
　　 SD大鼠40只,完全随机分为正常对照组10只、模型组30只。对照组喂养基础饲料:实验组喂养高脂饲料,每周两次(间隔一天)按0.05mL/kg皮下注射40%CCl4溶液[3],4周前实验组全部注射CCl4溶液,4周后当实验组大鼠出现轻度脂肪肝即停止注射CCl4溶液。
　　 于第4周将对照组10只SD大鼠及实验组随机抽取的10只SD大鼠标记后行超声及病理检查,各种检查均采用盲法。于第8周随机抽取10只实验组SD大鼠行超声及病理检查。于第12周对剩余的10只实验组SD大鼠行超声及病理检查。
　　 4、超声图像获取
　　 检查前禁食水一夜,次日用10%水合氯醛麻醉后胸腹部用8%Na2S溶液脱毛,准备完毕后SD大鼠取仰卧位置,采用PHILIPSiU22超声诊断仪,L12-5线阵探头,MSKSup条件,亮度80%,对比度55,深度为2.5cm,TGC(time gain compensation)曲线调节钮置于正中成一直线进行超声检查。探头于肋间横纵切分别观察大鼠的肝脏,留取肝肾对比切面图像。整个过程由同一位具有15年经验的超声医师进行。
　　 5、超声图像特征参数提取
　　 通过超声诊断仪PHILIPSiU22配备的图像传导功能将所留取的大鼠肝脏图像导入计算机。启动ImageJ软件图像分析系统,打开肝肾对比切面图像,绘制两个面积均为330mm2的圆形取样框,将其中一取样框停留于距皮表1.0±0.5cm肝实质处,计算该区域的Mean值得出肝脏均值(liver mean valueLM),将另一取样框停留于肾脏皮髓质交界处(50%皮质,50%髓质),避开肾柱位置[4],计算Mean值得出肾脏均值(renal mean valueRM)。两取样框尽量保持在同一垂直线上,该取值过程由3名不同研究人员进行3次,最终取平均值,使用MicrosoftExcel记录LM与RM,并计算出LM与RM的差值即肝肾均值(1iver-renal mean valueLRM)。
　　 6、病理检查方法
　　 超声观察完毕后立即处死大鼠,后再取1cm×1cm×0.5cm肝右叶浸入福尔马林液中固定,之后石蜡包埋,HE染色,观察肝细胞脂肪变情况,取5个视野,使用Image-ProPlus6.0软件进行脂滴计数和细胞计数,根据脂肪浸润的肝细胞数量占肝细胞总数的比例＜30%、30%-60%、＞60%分为轻度、中度及重度脂肪肝[5]。
　　 7、统计方法
　　 采用SPSS13.0统计软件处理各组数据,计量资料用均数±表均差表示,采用独立样本t检验比较组间均数,P＜0.05为差异有统计学意义,P＜0.01为差异有显著统计学意义;采用Kappa值分析评价使用LM、LRM指标进行诊断与组织学活检两种检查方法对脂肪肝分度的一致性。根据受试者工作特征曲线(receiver operating characteristiccurveROC)线选取灵敏度和特异度之和最大的点为分度诊断临界值,通过曲线下面积(areaunderthe curve AUC)评价诊断试验的准确性[6]。
　　 结果：
　　 (1)LM在正常组(no fatty liver NFL)与轻度脂肪肝组(light fatty liver LFL)的差异有显著统计学意义(P＜0.01),在轻度与中度、中度(medium fatty liver MFL)与重度脂肪肝组(severe fatty liver SFL)的差异有统计学意义(P＜0.05),RaM在正常组与轻度脂肪肝组、轻度与中度、中度与重度脂肪肝组的差异无统计学意义(P＞0.05),LRM在正常组与轻度脂肪肝组的差异有显著统计学意义(P＜0.01),在轻度与中度、中度与重度脂肪肝组的差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 (2)Kappa一致性检验,选取LM参数为诊断指标,超声检查与病理检查对于大鼠脂肪肝的诊断及分度诊断具有一致性,将40只大鼠分为脂肪肝组与非脂肪肝组,超声诊断与病理诊断,Kappa值为0.747。对于NFL与LFL大鼠的诊断,Kappa值为0.570,对于LFL与MFL大鼠的分度诊断,Kappa值为0.748,对于MFL与SFL大鼠的分度诊断,Kappa值为0.881。
　　 选取LRM参数为诊断指标,将40只大鼠分为脂肪肝组与非脂肪肝组,Kappa值为0.756。对于NFL与LFL大鼠的诊断,Kappa值为0.676,对于LFL与MFL大鼠的分度诊断,Kappa值为0.768,对于MFL与SFL大鼠的分度诊断,Kappa值为0.931。
　　 (3)通过LM指标诊断NFL与LFL,ROC的AUC为0.875,以52.9为大鼠NFL与LFL的临界值,敏感度(sensitivity Sen)和特异度(specificity Spe)为75.0%,91.7%;通过LM指标分级诊断MFL,AUC为0.808,以94.9为LFL与MFL的临界值,Sen和Spe为77.8%,90.0%:通过LM分级诊断SFL,AUC为0.860,以101.1为MFL与SFL的临界值,Sen和Spe为77.8%,87.1%。
　　 通过LRM指标诊断NFL与LFL,ROC的AUC为0.885,以-28.4为大鼠NFL与LFL的临界值,Sen和Spe为87.5%,91.7%;通过LRM分级诊断MFL,AUC为0.909,以10.9为LFL与MFL的临界值,Sen和Spe为85.8%,90.2%;通过LRM分级诊断SFL,AUC为0.950,以24.5为MFL与SFL的临界值,Sen:和Spe为88.9%,90.3%。
　　 结论：
　　 LM、LRM参数均可作为大鼠脂肪肝诊断的指标,LRM更适合作为大鼠脂肪肝分级诊断的指标,计算机辅助超声量化分析技术在大鼠脂肪肝诊断及分级诊断中与病理诊断具有较好的一致性,可以作为脂肪肝的常规的检查方法。这项技术提高了超声诊断的准确性,为临床前药理研究和基础研究中的脂肪肝模型动物的重复检查提供了一个新的非侵入性的检查方法。