氧化苦参碱诱导跨膜蛋白Claudin-1表达在重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜损害中的作用

摘要

目的:探讨氧化苦参碱(OM)靶向调控跨膜蛋白Claudin-1表达在重症急性胰腺炎(SAP)肠黏膜屏障损害中的作用及其机制。
　　 方法:采用L-精氨酸(17mg/100g)分2次间隔1h腹腔注射制备SAP大鼠模型。将84只大鼠随机分为Control组(n=7);OM对照组(n=7);SAP组(n=35),SAP组又分为建模后2h、12h、24h、36h、48h,5个亚组(每亚组7只);OM治疗组(n=35),OM治疗组又分为建模后2h、12h、24h、36h、48h,5个亚组(每亚组7只)。
　　 Control组:7只大鼠分2次腹腔注射生理盐水(1.75ml/100g、间隔1h);48h后处死;
　　 OM对照组:7只大鼠,给予氧化苦参碱(50mg/kg)直肠保留灌肠(灌肠后把大鼠吊起,头向下,治疗8分钟,每24h一次);48h后处死;
　　 SAP组:分为建模后2h、12h、24h、36h、48h,5个亚组(每亚组7只)35只大鼠分2次腹腔注射L-精氨酸溶液(各175mg/100g、间隔1h),建模后2h、12h、24h、36h,48h处死相应亚组大鼠;
　　 OM治疗组:分为建模后2h、12h、24h、36h、48h,5个亚组(每亚组7只),35只大鼠分2次腹腔注射L-精氨酸溶液(各175mg/100g、间隔1h),第二次注射L-精氨酸后1h开始给予氧化苦参碱(50mg/kg)直肠保留灌肠治疗(灌肠后把大鼠吊起,头向下,治疗8分钟,每24h一次),建模后2h、12h、24h、36h,48h处死相应亚组大鼠。
　　 上述各组处死后的大鼠,门静脉穿刺取血,静置2h后,以3800r/min离心3min,取血清-20℃冻存;取胰腺组织、结肠黏膜组织2.5%戊二醛固定,制成石蜡切片保存。
　　 测定血浆淀粉酶、D-乳酸、内毒素浓度变化;用荧光定量PCR方法检测结肠黏膜组织跨膜蛋白Claudin-1mRNA表达;Westernblot方法检测结肠黏膜组织Claudin-1蛋白水平;免疫组化技术检测结肠黏膜组织Claudin-1蛋白表达。胰腺及结肠黏膜组织进行病理学光镜观察;透射电镜下观察结肠黏膜上皮组织细胞紧密连接形态改变。
　　 结果:通过对大鼠血浆淀粉酶的测定及胰腺组织HE染色切片的光镜检查表明:SAP组、OM治疗组的各亚组血浆淀粉酶活性有显著变化(P＜0.01);Control组与OM对照组比较血浆淀粉酶活性无统计学意义(P＞0.05);SAP组2h亚组与Control组比较血浆淀粉酶活性显著升高(P＜0.01),并且在建模后36h达到峰值,之后逐渐下降;HE染色光镜检查SAP组2h亚组胰腺组织胰腺小叶结构破坏、消失,腺体数量减少,小叶间、小叶内间隔、腺泡间隔增宽,腺泡细胞局灶性坏死,周围有炎性细胞浸润,血管扩张充血并有红细胞漏到血管外,这说明应用L-精氨酸制作大鼠SAP模型成功。
　　 通过对大鼠血浆D-乳酸、内毒素浓度检测发现:Control组与OM对照组比较大鼠血浆D-乳酸、内毒素浓度无统计学意义(P＞0.05):SAP组2h亚组与Control组对比血浆D-乳酸、内毒素浓度显著升高(P＜0.01),提示胰腺炎模型早期便存在肠黏膜屏障破坏,肠黏膜通透性增加,细菌移位;OM治疗组各亚组与同时间点位的SAP组各亚组进行两两比较,OM干预后大鼠血浆D-乳酸、内毒素浓度较同时点的SAP各亚组显著下降(P＜0.05),提示OM干预可修复肠黏膜屏障,恢复肠黏膜通透性,防止细菌移位,从而降低血浆D-乳酸、内毒素浓度。
　　 通过对大鼠结肠黏膜组织中Claudin-1蛋白表达、Claudin-lmRNA表达及Claudin-1免疫组化光密度分析提示:Control组与OM对照组比较大鼠结肠黏膜组织中Ciaudin-1表达无统计学意义(P＞0.05);SAP组2h亚组与Control组对比结肠黏膜组织中Claudin-1表达显著下降(P＜0.01),提示胰腺炎模型早期便发生结肠黏膜组织中Claudin-1表达下调;OM治疗组各亚组与同时间点位的SAP组各亚组进行两两比较提示,OM干预后结肠黏膜组织中Claudin-1表达逐步恢复,表达增强,36h亚组、48h亚组中OM治疗组的Claudin-1表达较同时点SAP组显著提高(P＜0.05),提示OM有上调Claudin-1表达的作用。
　　 通过对大鼠结肠黏膜组织光镜和电镜观察提示:Control组结肠黏膜腺体排列紧密、规整,绒毛高度及黏膜层厚度正常;SAP组24h亚组结肠黏膜间质层明显充血、水肿、淋巴管扩张、绒毛增粗,并见单核细胞及中性粒细胞浸润,柱状上皮细胞坏死、脱落、部分绒毛脱落、缺损,绒毛高度降低、黏膜层变薄。SAP组24h亚组与Control组比较结肠黏膜绒毛高度和隐窝深度明显降低(P＞0.01);透射电镜下观察结肠黏膜上皮细胞形态改变:与Control组比较SAP组黏膜上皮细胞表面微绒毛疏松,变长,部分脱落,胞质内细胞器数量减少,部分线粒体肿胀,嵴断裂,呈空泡样改变,偶见粗面内质网,表面核糖体脱落,细胞间紧密连接增宽,密度增强。从SAP组及OM治疗组2h、12h、24h亚组图片可见紧密连接的结构发生中断、增宽、密度增强,并有局部膜融合。OM治疗组48h亚组与SAP组48h亚组图片比较紧密连接部结构明显好转,得到一定程度的修复。这提示SAP时结肠黏膜上皮细胞遭到损害,细胞间紧密连接被破坏,而OM干预可有效地恢复细胞间紧密连接,改善肠黏膜屏障功能。
　　 结论:SAP损伤导致血浆内毒素、D-乳酸浓度升高,结肠黏膜组织Claudin-1mRNA、蛋白表达降低,OM干预可明显减少血浆内毒素、D-乳酸的产生,上调结肠黏膜组织Claudin-1表达,改善肠黏膜屏障功能,阻止细菌移位。