阿尔茨海默病患者血小板膜脂质筏内胆固醇含量的研究

摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer'S disease，AD）是以渐进性记忆力和智能减退为特征的弥漫性中枢神经系统退行性疾病，是痴呆中最常见的一种类型。目前随着世界人口老龄化的加速，AD的发病率大幅度攀升，已成为仅次于心脏病，癌症及中风的第四位导致死亡的疾病。AD患者的生活质量严重下降，同时给家属及社会带来了严重的经济和人文负担。因此AD成了世界各国予以攻克的瞩目问题，对其早期诊断及治疗已成为亟待解决的社会问题。
　　 AD的显著的神经组织学病理特征为大脑皮质和海马神经细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)沉积，而脑组织内淀粉样前体蛋白(APP)片段异常增加和聚集是导致神经元死亡的主要原因。Aβ的产生和聚集是重要的因素之一，而且是AD最早、最特征性的改变，被认为是AD发病的关键环节。脂质筏为膜脂双层内含有胆固醇和鞘脂的微区，参与信号转导、蛋白质和脂质的胞吞和细胞内转运过程，同时与神经退行性疾病，血管生成等过程有关。此外，脂质筏参与Aβ的产生、聚集形成低聚体。因此脂质筏在AD的病理发生及发展过程中发挥着重要作用。血小板中含有APP的代谢产物可溶性APP和Aβ，并可产生大量的可溶性Aβ。研究发现，AD患者的血小板中APP代谢异常。细胞培养证实，胆固醇代谢影响APP裂解生成Aβ的过程，而这一过程在膜脂双层内富含胆固醇的微区--脂质筏中进行。因此，血小板膜脂质筏内胆固醇含量与AD发病的研究显得十分必要，但目前相关研究很少。
　　 目的：
　　 本研究首先利用Optiprep作为梯度离心介质制备血小板膜脂质筏并进行脂质筏的鉴定。检测血小板膜脂质筏内胆固醇的含量，然后探讨在智能正常志愿者人群中不同年龄及性别分布对血小板膜脂质筏内胆固醇的影响关系。最后探讨血小板膜脂质筏内胆固醇含量与AD发病的相关性。
　　 方法：
　　 室温下离心血样;Tyrode'S液制备血小板悬液;4℃下用去垢剂(如:Triton-100)将非脂筏成分溶解清除;利用Optiprep作为梯度离心介质，将脂质筏组分离心收集;利用辣根过氧化物酶标记的霍乱毒素β亚基（CTB-HRP），采用点印迹法进行脂质筏的鉴定;利用Amplex red cholesterol Assay kit（美国Invitrogen公司）进行血小板膜脂质筏的胆固醇含量测定;应用GraphPad Prism5.00软件对所得数据进行统计学处理，以P＜0.05为检验水准。
　　 结果：
　　 1、利用去垢剂法，采用Optiprep密度梯度超速离心法成功制备血小板膜脂质筏。离心管内Optiprep25％-30％交界面处出现一层去污剂不溶性的絮状物形成的白色的闪亮的环带，即脂质筏所在部位。
　　 2、利用霍乱毒素β亚基对脂质筏的标志分子神经节苷脂GM1进行检测，结果示仅第6层的样本检测到GM1形成的沉淀，与可见光下肉眼所见相符，说明脂质筏分布在第6层的白色环带，即25％-30％密度梯度离心界面中。
　　 3、胆固醇检测结果显示，在第6层中含有较高浓度的胆固醇。
　　 4、检测年龄对血小板膜脂质筏内胆固醇含量的影响。健康志愿者40人，分为60岁以上组以及60岁以下组。结果显示，60岁以下组血小板膜脂质筏内胆固醇含量均值为14.48±6.382μg/ml;60岁以上组为17.19±5.297μg/ml。P＞0.05，两组间差异无统计学意义。
　　 5、检测性别对血小板膜脂质筏内胆固醇含量的影响。健康志愿者40人，其中男性18人，女性22人。男性组胆固醇平均含量为17.423±5.658μg/ml，女性组平均为18.112±6.142μg/ml。P＞0.05，两组间差异无统计学意义。
　　 6、AD组患者15人，血小板膜脂质筏内胆固醇含量均值为23.87±3.1681μg/ml;对照组15人，血小板膜脂质筏内胆固醇含量均值为16.812±2.1572μg/ml。 P＜0.01，两组间差异有统计学意义。
　　 结论：
　　 1、Optiprer密度梯度离心方法制备血小板膜脂质筏的方法简便易行可大大缩短制备所需时间。
　　 2、脂质筏存在于血小板离心标本的第6层，含有大量的胆固醇。
　　 3、血小板膜脂质筏内胆固醇含量与年龄及性别无关。
　　 4、AD组患者血小板膜脂质筏内胆固醇含量与对照组相比显著增高，血小板膜脂质筏内胆固醇水平与AD发病具有相关性。

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