血小板脂质筏内蛋白、胆固醇及神经节苷脂GM1含量与阿尔茨海默病的关联性研究

摘要

研究背景：
　　 阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是痴呆中最常见的一种类型,是以渐进性记忆力和智能减退为特征的弥漫性中枢神经系统退行性疾病。目前AD已成为导致成年人死亡的第四位主要原因,仅次于心脏病,癌症及中风。阿尔茨海默病显著的神经组织学病理特征为大脑皮质和海马神经细胞外β-淀粉样蛋白沉积形成的老年斑和脑神经细胞内tau蛋白异常聚集形成神经元纤维缠结。虽然关于阿尔茨海默病的具体发病机制仍不十分明确,但脑组织内淀粉样蛋白片段异常增加和聚集是导致神经元死亡的主要原因,故Aβ的产生和聚集被认为是重要的因素之一,而且是AD最早、最特征性的改变,是AD发病的关键环节。
　　 脂质筏为膜脂双层内含有特殊脂质和蛋白的微区,富含胆固醇和鞘脂。目前研究表明脂质筏在AD的病理发生及发展过程中发挥重要作用,其参与Aβ致AD发病的全部过程。而血小板因其APP异构体浓度与脑中APP异构体浓度相当,具有APP代谢所必需的酶系,且是90%的血源性可溶性Aβ的来源,目前普遍认为,血小板可能反映了AD疾病中神经元的发病机制,常将血小板作为AD研究的外周模式系统。因此本研究检测不同年龄智能正常人群及AD患者外周血血小板中脂质筏成分-神经节苷脂GM1,胆固醇及蛋白的水平,从而探讨血小板中脂质筏成分-神经节苷脂GM1,胆固醇及蛋白与AD的相关性,以期寻找到对AD诊断具有辅助作用的生物学标志物。
　　 研究目的：
　　 建立一种用Optiprep作为梯度离心介质制备血小板脂质筏的方法。探讨不同年龄智能正常成人血小板脂质筏内蛋白、胆固醇及神经节苷脂GM1的含量与增龄之间的关系。探讨血小板脂质筏内蛋白、胆固醇及神经节苷脂GM1的含量与AD之间的关系及其在AD诊断中的价值。
　　 研究方法：
　　 AD组所有患者来自2010年3月-2011年12月于中国医科大学附属第一医院神经内科门诊就诊或住院患者,共计22例,其中男性10例,女性12例,年龄53-83岁。中青年组、老年组及对照组来自中国医科大学附属第一医院体检中心,共32例,其中男性15例,女性17例,年龄32-83岁。所采集标本须柠檬酸钠抗凝收集新鲜处理,依据脂质筏在4℃不溶于去垢剂的特性,用去垢剂处理细胞膜成分,溶解非脂质筏成分,以Optiprep为介质进行密度梯度离心5小时,分离去垢剂不溶组分。.用神经节苷脂GM1作为脂质筏的特异性标志分子,应用点印迹的方法进行定性鉴定。对密度梯度离心后所得的10层样品,采用BCA法测定各层内蛋白含量,分子探针法测定各层胆固醇含量,比色法及点印迹法测定各层神经节苷脂GM1含量,了解各层内蛋白、胆固醇及神经节苷脂GM1分布情况,探讨血小板脂质筏内蛋白、胆固醇、神经节苷脂GM1含量与增龄及AD发病之间的关系。应用GraphPadPrism5.00软件对所得数据进行统计学处理,以P＜0.05为检验水准。
　　 研究结果：
　　 1、在离心管25%-30%Optiprep溶液界面处可见一条白色的闪亮环带,经点印迹法检测神经节苷脂GM1的分布证实,脂质筏位于第6层,与肉眼所见相符,该白色闪亮环带即为脂质筏所在部位。
　　 2、Optiprep密度梯度离心后获得的第6层样品,即脂质筏所在层的蛋白含量很少,仅占总蛋白的3%左右,而第7-10层所含蛋白约占总蛋白的97%,第1-5层几乎无蛋白存在。
　　 3、Optiprep密度梯度离心后获得的第6层样品,即脂质筏所在层富含胆固醇,其胆固醇含量约为总胆固醇含量的53%,其次为第一层,其胆固醇含量约占总胆固醇含量的22%,其余层几乎无胆固醇存在。
　　 4、Optiprep密度梯度离心后获得的10层样品中,神经节苷脂GM1主要位于第6层中,除第10层样品外,其余层几乎无GM1的存在,第10层内GM1的含量约占总重的13%。
　　 5、中青年组血小板脂质筏内蛋白含量均值为192.3±10.90μg/ml,老年组血小板脂质筏内蛋白含量均值为172.9±13.63μg/ml,老年组血小板脂质筏内蛋白含量略低于中青年组,但无统计学差异(t=1.111,p=0.2753)。
　　 6、中青年组血小板脂质筏内胆固醇含量均值为16.18±0.6582μg/ml,老年组血小板脂质筏内胆固醇含量均值为17.19±0.8697μg/ml,老年组血小板脂质筏内胆固醇含量略高于中青年组,但无统计学差异(t=0.9317,p=0.3590)。
　　 7、中青年组患者血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量经比色法测定的均值为577.7±15.07μUCTB-HRPactivity,经点印迹定量法测定的均值为14280±902.4,老年组血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量经比色法测定的均值为595.9±15.46LLUCTB-HRPactivity,经点印迹定量法测定的均值为15040±688.7,老年组血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量略高于中青年组,但无统计学差异(比色法:t=0.8421,p=0.4064;点印迹法:t=0.5960,p=0.5557)。
　　 8、AD组患者血小板脂质筏内蛋白含量均值为208.6±9.61μg/ml,对照组血小板脂质筏内蛋白含量均值为187.9±10.29μg/ml,AD组患者血小板脂质筏内蛋白含量略高于对照组,但无统计学差异(t=1.469,p=0.1494)。
　　 9、AD组患者血小板脂质筏内胆固醇含量均值为24.44±1.068μg/ml,对照组血小板脂质筏内胆固醇含量均值为16.76±0.7542μg/ml,AD组患者血小板脂质筏内胆固醇水平高于对照组,且有极显著统计学差异(t=5.872,P＜0.0001)。
　　 10、AD组患者血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量经比色法测定的均值为784.1±17.38μUCTB-HRPactivity,经点印迹定量法测定的均值为24510±825.2,对照组血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量经比色法测定的均值为594.7±12.91μUCTB-HRPactivitv,经点印迹定量法测定的均值为15110±688.7,AD组血小板脂质筏内神经节苷脂GM1水平高于对照组,且有极显著统计学差异(比色法:t=8.747,p＜0.0001;点印迹法t=8.747,P＜0.0001)。
　　 结论：
　　 1、用Optipr印作为密度梯度离心介质制备血小板脂质筏的方法简便,易行,比传统的蔗糖梯度离心法大大缩短制备所需时间。
　　 2、智能正常成人血小板脂质筏内成分一蛋白、胆固醇及神经节苷脂GM1含量与增龄无直接关系。
　　 3、AD组患者血小板脂质筏内神经节苷脂GM1和胆固醇含量明显高于对照组,血小板脂质筏内神经节苷脂GM1和胆固醇水平与AD发病显著相关。
　　 4、血小板脂质筏内蛋白含量与AD发病无相关性.
　　 5、血小板脂质筏内神经节苷脂GM1和胆固醇含量测定在AD诊断中有临床应用价值,是诊断AD可能的生化指标,有望成为诊断AD的外周生物学指标。