支气管肺发育不良模型中ZONAB调节肺泡上皮细胞增殖及转分化的研究

摘要

支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)是围生期肺损伤造成的一种慢性呼吸疾病，是早产造成的最常见的严重并发症之一。最早是在1967年由Northway报道并命名，在早产儿中常见，具有特殊的临床、组织学及影像学特征。BPD患儿需要长期吸氧，即使出院后也有很大部分需要家庭氧疗，且预后可能长期遗留呼吸系统及神经系统后遗症。随着早产儿，特别是极低出生体重儿(very low birth weight，VLBW)生存率的提高，BPD发生率仍然居高不下。
　　哺乳动物有两种肺泡上皮细胞，两者互相协调以维持正常的气体交换功能。Ⅰ型肺泡上皮细胞(typeⅠ alveolar epithelial cells，AECⅠ)覆盖近96％肺泡腔，与邻近的毛细血管壁紧密相贴，是气血屏障的主要上皮成分，具有气体交换功能。Ⅱ型肺泡上皮细胞（TypeⅡ alveolar epithelial cells，AECⅡ）是肺泡上皮细胞的“祖细胞”，既能增殖成新的AECⅡ，还可以转分化为AECⅠ，肺损伤时AECⅡ向AECⅠ转分化是损伤修复的一种重要机制。AECⅡ损伤一直被认为是BPD肺上皮损伤的关键机制，许多研究发现BPD中AECⅡ发生坏死、凋亡、DNA损伤、氧化应激损伤等，并认为是BPD发生的病理基础。但我们前期研究发现AECⅡ特异性标志物SP-C不但没有减少反而增加，表明在BPD发生时并没有AECⅡ功能的改变，提示AECⅡ损伤并非BPD肺上皮修复障碍的唯一机制。那么是否存在AECⅡ向AECⅠ转分化异常呢，是否存在AECⅡ增殖异常呢。目前关于调节肺泡上皮细胞转分化及增殖异常机制的研究尚不完善。
　　我们已有研究发现高氧致肺损伤时密闭小带(ZO)蛋白-1及跨膜蛋白occludin表达减少，且考虑与同时存在的肺泡上皮紧密连接开放及肺水肿发生有关。ZO-1有4种结构域:PDZ，SH3，GK和酸性结构域，其通过PDZ结构域与occludin结合，通过SH3结构域与ZO-1-associated nucleic acid binding proteins(ZONAB)结合。ZONAB是一种转录因子，在视网膜色素上皮细胞和肾脏近曲小管细胞等的研究中发现其具有促进细胞增殖抑制细胞分化的转录活性。ZONAB穿梭于紧密连接与细胞核之间，ZONAB位于核内时能够参与基因表达的调节，与ZO-1的结合使ZONAB局限于细胞质，抑制了ZONAB的转录活性。由此我们推测，ZO-1通过与occludin结合参与高氧致肺损伤时肺水肿的发生，是否同时通过与ZONAB的结合在另一途径中参与调节肺泡上皮细胞的增殖及转分化进而介导BPD发生呢。那么BPD模型中转分化及增殖异常的调节因素中是否有ZONAB参与呢。
　　因此，我们在三个水平上检测了肺泡上皮细胞中肺泡上皮细胞的转分化和增殖水平及ZONAB的表达情况:(1)高氧致新生鼠BPD动物模型及对照组的肺组织;(2)从动物模型肺组织分离的AECⅡ标本;(3)从正常新生鼠分离的AECⅡ体外正常及高氧条件下原代培养。然后应用体外原代培养的AECⅡ为模型，利用质粒转染及siRNA转染技术调节ZONAB表达量，观察细胞增殖及转分化指标变化，以验证ZONAB对肺泡上皮细胞增殖及转分化的调节作用。从而说明在高氧致BPD模型中转录因子ZONAB对肺泡上皮细胞增殖及转分化的调节作用，为进一步认识BPD发病机制和病理生理基础开辟新的思路。
　　实验材料与方法:
　　一、动物模型制备与标本采集
　　足月新生Wistar大鼠（连同母鼠）于生后12h(0d)内随机分为2组:BPD模型组（吸入氧浓度为85％）和对照组（吸入空气）。将模型组新生大鼠在生后12h内置于玻璃氧舱中，持续输入氧气，维持氧浓度在85％（测氧仪监测）。于暴露第1、3、7、14、21天分别从两组动物中随机抽取8只麻醉后取肺组织留标本。
　　二、细胞分离及培养
　　1、新生鼠AECⅡ分离:生后24小时以内的新生鼠，经5％水合氯醛腹腔麻醉后处死，无菌条件下迅速取肺，剪碎、漂洗后，采用胰酶、胶原酶分步消化，经差速离心、差速贴壁、IgG免疫黏附、次日换液等方法纯化后，得到较纯的AECⅡ。台盼蓝染色检测细胞活力在95％以上，表面活性蛋白C(surfactantassociated protein C，SP-C)免疫荧光染色显示细胞纯度为90％。
　　2、原代细胞培养:分离细胞24小时后换液，之后随机分为模型组及对照组。模型组置于高氧孵箱(85％ O2-5％ CO2)中，对照组置于普通孵箱(21％ O2-5％CO2)中继续培养48小时。
　　3、从BPD模型组及对照组鼠肺中分离AECⅡ: BPD模型组及对照组大鼠在高氧或空气暴露7，14，21天时，予以麻醉及分离肺组织，提取AECⅡ，具体方法同上。
　　三、细胞质粒转染及siRNA转染
　　体外原代培养的由新生鼠分离的AECⅡ，利用转染试剂Attractene转染ZONAB过表达质粒pCMV6-ZONAB及空载体pCMV6，利用转染试剂DharmaFECT1转染ZONAB特异性siRNA和非特异性siRNA。
　　四、实验方法及观察指标
　　（一）肺组织HE染色:普通光学显微镜下观察肺组织病理改变，测定辐射状肺泡计数(radial alveolar counts，RAC)值。
　　（二）倒置相差显微镜观察细胞形态
　　（三）组织免疫荧光染色:观察肺泡上皮细胞ZONAB/表面活性蛋白C(surfactant associated protein C，SP-C)共表达、肺内支气管上皮ZONAB表达及肺泡上皮细胞水通道蛋白5(aquaporin5，AQP5)/SP-C共表达情况。
　　（四）细胞免疫荧光:观察模型组与对照组的体外原代培养AECⅡ中ZONAB表达、AQP5/SP-C共表达情况，质粒转染pCMV6-ZONAB与空载体pCMV6组AQP5/SP-C共表达情况，转染ZONAB特异性siRNA与非特异性siRNA组AQPS/SP-C共表达情况。
　　（五）western blot:检测组织及细胞标本的ZONAB（总蛋白及核蛋白）、AQP5、SP-C、PCNA、cyclin D1等蛋白表达情况。
　　（六）real-time PCR:检测组织及细胞标本的ZONAB、AQP5、SP-C、PCNA等mRNA表达情况。
　　（七）透射电镜:观察肺组织肺泡上皮细胞、紧密连接及气血屏障的超微结构。
　　五、统计学分析
　　应用SPSS19.0统计软件进行统计学处理，数据以均值士标准差表示，两样本均数间比较采用未配对t检验，两样本率间比较采用x2检验。结果以P＜0.05认为有统计学意义。
　　结果:
　　一、肺组织的形态学改变
　　1、HE染色光镜观察形态学改变
　　观察结果发现随着高氧暴露时间延长，肺组织损伤越来越严重，主要表现为肺泡化受阻，符合BPD的病理特点。
　　2、两组大鼠肺组织RAC值对比
　　辐射状肺泡计数（RAC）是评价肺发育的一项重要指标，结果发现BPD模型组从高氧暴露7d开始肺泡数量明显较对照组减少(P＜0.05)，暴露14天和21天变化更加明显(P＜0.001)，提示出现肺泡化受阻。
　　二、BPD模型肺组织中AECII转分化增多
　　组织免疫荧光双标染色中，BPD模型组从高氧暴露7d开始SP-C及AQP5表达均较对照组增多、紊乱，且双染细胞较对照组明显增多。经过量化后，双染细胞/SP-C阳性细胞百分比在模型组中从高氧暴露7天开始明显升高(p＜0.001)，提示BPD模型组鼠肺组织内肺上皮细胞的转分化水平明显增高。
　　western blot及real-time PCR方法定量后发现，模型组从高氧暴露1d开始AQP5表达口有所增加(p＜0.05)。SP-C表达在高氧暴露1d和3d较正常组略有减少，从7d起模型组表达较对照组增多，高氧暴露14d和21d模型组较对照组表达明显增多(p＜0.05)。
　　三、BPD模型中肺泡上皮细胞结构及气血屏障损伤，细胞间紧密连接开放
　　透射电镜观察结果显示对照组鼠肺组织内可见肺泡上皮细胞形态规则，细胞器完整，细胞间紧密连接结构完好，连接致密，气血屏障三层结构清晰连贯。BPD模型组中高氧暴露7d发现AECⅡ向AECⅠ发生转分化，表现为:板层小体排出、空泡化，微绒毛减少，细胞形态及细胞核变扁平。上皮细胞之间的紧密连接不规则变宽，部分气血屏障三层结构融合，模糊不清。高氧14d发现AECⅠ形态变圆、孤立，突向肺泡腔，细胞核有切迹，核内异染色质边集;AECⅡ破坏更严重，细胞膜破裂，细胞核突向腔面，板层小体大量排出，气血屏障局部不规则，三层结构融合。高氧21 dAECⅠ之间及AECⅡ之间的紧密连接开放及气血屏障局部模糊更为普遍。
　　四、从BPD模型组和对照组鼠肺分离的细胞中AEC标志物发生变化
　　Western blot和real-time PCR结果发现，从高氧暴露7d开始模型组细胞AQP5表达较对照组增多(p＜0.05)，SP-C表达较对照组中减少(p＜0.05)。
　　五、新生鼠分离的AECⅡ在体外细胞培养中转分化水平受环境氧浓度调控
　　倒置相差显微镜观察可见分离后24h AECⅡ呈立方形岛状生长，有较多伪足伸出。72h后对照组细胞伸展，体积变大，发生形态改变。模型组细胞伸展、肥大、变形更加明显，且细胞总数减少，培养液中悬浮细胞增多。免疫荧光双染观察，分离24h后细胞内主要为SP-C表达，AQP5表达很少。72h后两组均有SP-C和AQP5共表达，提示都出现了AECⅡ向AECⅠ的转分化。但与对照组相比，模型组共表达的细胞更多，AQP5表达更多，SP-C表达更少，说明转分化程度更高。应用western blot和real-time PCR方法检测AQP5和SP-C两种细胞标志物的蛋白和mRNA表达水平，结果也提示模型组中AQP5表达升高，SP-C表达降低。
　　六、BPD模型组肺组织中ZONAB表达异常
　　1、western blot方法检测肺组织内ZONAB表达
　　BPD模型组较对照组比较，从高氧暴露1天开始ZONAB的表达量即有所增加，且这种增加的趋势持续至高氧暴露21天(P＜0.05)。
　　2、肺泡上皮免疫荧光双标ZONAB/SP-C
　　BPD模型组中高氧暴露14天和21天时标记为红色的AECⅡ中几乎没有绿色荧光表达，提示AECⅡ表达ZONAB明显减少。
　　3、支气管上皮表达ZONAB
　　ZONAB在模型组支气管上皮细胞中从高氧暴露7天开始表达即较对照组增加。
　　七、从BPD模型组和对照组鼠肺分离的AECⅡ中ZONAB表达变化
　　为了去除肺组织内其他细胞成分的影响，我们从对照组及BPD模型组不同时间点（7天，14天，21天）的鼠肺内分离了AECⅡ，并直接从取得的细胞标本中提取目的蛋白及mRNA进一步定量。Western blot及real-time PCR结果均发现从高氧暴露7天开始模型组ZONAB表达较对照组减少(P＜0.001)。
　　八、体外原代培养的AECⅡ中ZONAB表达情况
　　细胞免疫荧光染色可见对照组中ZONAB表达较多，且多位于细胞连接处及细胞核内，而模型组ZONAB表达量较少，且聚集于胞浆，细胞连接处及核内均很少。western blot及real-time PCR方法检测ZONAB的蛋白及mRNA表达情况，均提示模型组较对照组表达减少，且细胞核内ZONAB蛋白表达量下降更明显。
　　九、ZONAB过表达促进AECⅡ增殖，抑制其转分化
　　1、转染pCMV6-ZONAB后细胞表达ZONAB增加
　　原代培养的AECⅡ转染质粒后，应用real-time PCR及western blot方法验证后，发现实验组（转染pCMV6-ZONAB）表达ZONAB较对照组（转染pCMV6）明显增加，细胞核内ZONAB也明显增加。
　　2、转染pCMV6-ZONAB后细胞转分化减少
　　原代培养的AECⅡ转染质粒后，AECⅠ标志物AQP5表达明显减少，AECⅡ标志物SP-C表达明显增多，提示细胞转分化水平降低。细胞免疫荧光双标可见实验组较对照组AQP5表达减少，SP-C表达增多。
　　3、转染pCMV6-ZONAB后细胞增殖增加
　　原代培养的AECⅡ转染质粒后，细胞增殖指标PCNA及cyclin D1表达明显增多，提示细胞增殖水平增高。
　　十、ZONAB低表达促进AECⅡ转分化，抑制其增殖
　　1、转染ZONAB siRNA后细胞表达ZONAB减少
　　原代培养的AECⅡ转染ZONABsiRNA后，应用real-time PCR及western blot方法验证后，发现实验组（转染特异性siRNA）表达ZONAB较对照组（转染非特异性siRNA）明显减少，细胞核内ZONAB表达也明显减少。
　　2、转染ZONAB siRNA后细胞转分化增加
　　原代培养的AECⅡ转染特异性siRNA后，AECⅠ标志物AQP5表达明显增多，AECⅡ标志物SP-C表达明显减少，提示细胞转分化水平增高.细胞免疫荧光双标可见实验组较对照组AQP5表达增多，SP-C表达减少。
　　3、转染ZONAB siRNA后细胞增殖减少
　　原代培养的AECⅡ转染特异性siRNA后，细胞增殖指标PCNA及cyclin D1表达明显减少，提示细胞增殖水平降低。
　　结论:
　　1、在体内及体外支气管肺发育不良模型中，Ⅱ型肺泡上皮细胞不但无增殖障碍，而且向Ⅰ型肺泡上皮细胞转分化增多。
　　2、支气管肺发育不良模型中，虽然Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖及转分化均增多，但仍然不能弥补肺上皮屏障功能的破坏。
　　3、ZONAB作为调节细胞增殖及分化的重要转录因子，在正常发育的肺泡上皮中有表达，但暴露于高氧后型肺泡上皮细胞表达ZONAB减少，这种ZONAB表达异常可能导致Ⅱ型肺泡上皮细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞转分化增多。
　　4、体外原代培养的Ⅱ型肺泡上皮细胞通过基因转染的方法证实，ZONAB具有促进肺泡上皮细胞增殖，抑制其转分化的作用。因此，适当调控肺泡上皮细胞中ZONAB的表达量可能是调节肺上皮损伤后修复的一条新途径，也成为研究支气管肺发育不良防治方法的一个新靶点。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 支气管肺发育不良模型中肺泡上皮细胞转分化增加伴有结构及功能破坏

前言

实验材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 支气管肺发育不良模型中转录因子ZONAB的表达变化

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 转录因子ZONAB促进Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖抑制其转分化

前言

实验材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 ZONAB与紧密连接

在学期间科研成绩

致谢

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