长链非编码RNA HOTAIR调节人晶状体上皮细胞增殖、迁移、上皮间质转分化中的作用

摘要

目的：1.构建转化生长因子-β2（transforming growth factor,TGF-β2）诱导的人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLECs）发生上皮间质转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的细胞模型，检测细胞中长链非编码RNA HOTAIR（lncRNA HOTAIR）的表达。2.探讨HOTAIR在TGF-β2诱导的HLECs增殖、迁移、EMT过程中的作用。3.检测TGF-β/Smad通路主要信号分子在TGF-β诱导人晶状体上皮细胞EMT过程中的表达变化及HOTAIR是否通过TGF-β/Smad通路在晶状体上皮细胞EMT过程中发挥作用。　　方法：1.构建TGF-β2诱导的人晶状体上皮细胞EMT的细胞模型，检测SRA01/04细胞中HOTAIR的表达。常规体外培养人晶状体上皮细胞株SRA01/04，用10ng/ml TGF-β2处理细胞24小时后，用倒置显微镜观察细胞形态变化，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、免疫印迹（western blot）检测HLECs中EMT相关标记物基因及蛋白的表达，如上皮细胞标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）、紧密连接蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）及间质细胞标志物波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）。应用qRT-PCR检测TGF-β2(10ng/mL)不同作用时间（0小时，12小时，24小时，48小时，72小时）对晶状体上皮细胞HOTAIR的表达影响。2.下调HOTAIR的表达，探讨HOTAIR在HLECs增殖、迁移中的作用。应用RNA小干扰技术，在SRA01/04细胞中转染siHOTAIR-1、siHOTAIR-2和siHOTAIR-3及对照组siNC，并检测转染效率，细胞活力和增殖能力分别通过CCK-8和EDU实验检测，Transwell迁移试验用于细胞迁移能力的检测。3.观察HOTAIR在TGF-β2诱导的HLECs增殖、迁移、EMT过程中的作用，检测EMT相关转录因子的表达变化。细胞分为四组：siNC组：细胞中转染siNC，常规培养HLECs（SRA01/04）24小时；siHOTAIR：细胞中转染siHOTAIR，常规培养HLECs（SRA01/04）24小时；siNC+TGF-β2组：细胞中转染siNC，培养基加入10ng/ml TGF-β2，培养24小时；si-HOTAIR+TGF-β2组：细胞转染siHOTAIR，培养基培养加入10ng/ml TGF-β2，培养24小时。应用倒置显微镜检测观察细胞形态，免疫荧光、western blot检测EMT相关蛋白（E-cadherin、ZO-1、vimentin、α-SMA）的表达，western blot检测转录因子ZEB1、Snail、Slug的表达，细胞活力和增殖能力分别通过CCK-8和EDU实验检测，Transwell迁移及划痕试验同时用于细胞迁移能力的检测。4.TGF-β/Smad通路主要信号分子在TGF-β2作用下HLECs中的表达。下调SRA01/04细胞HOTAIR的表达，检测TGF-β/Smad通路蛋白的表达变化。10ng/ml TGF-β2作用细胞后，western blot检测TGF-β2作用下HLECs中磷酸化Smad2，Smad3及总的Smad2，Smad3表达水平的变化，SRA01/04细胞转染siHOAIR或siNC，10ng/ml TGF-β2作用细胞后，western blot检测HLECs中p-Smad2，Smad3及总的Smad2，Smad3表达水平的变化。　　结果：1.成功构建TGF-β2诱导的人晶状体上皮细胞EMT的细胞模型，细胞中HOTAIR的表达增加。倒置显微镜观察发现与对照组相比（未被TGF-β2处理），TGF-β2处理的实验组细胞发生EMT转变，细胞由原来的椭圆形变为长梭状。qRT-PCR、Western blot检测TGF-β2诱导SRA01/04细胞上皮间质转分化，结果发现：与未经TGF-β2处理的对照组相比，实验组的SRA01/04细胞上皮细胞标志物E-cadherin、ZO-1表达降低，间质细胞标志物vimentin、α-SMA表达增加，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。qRT-PCR技术检测TGF-β2作用不同时间晶状体上皮细胞HOTAIR的表达，结果发现TGF-β2作用12h，HOTAIR表达开始增加，48h达到最高值，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。2.成功筛选沉默HOTAIR的siHOTAIR，沉默晶状体上皮细胞HOTAIR的表达可以抑制HLECs存活、增殖及迁移。qRT-PCR技术筛选结果显示：与对照组相比，siHOTAIR-2和siHOTAIR-3可有效沉默HOTAIR的表达（*P＜0.05,**P＜0.01），差异具有统计学意义。最终选择siHOTAIR-3行进一步实验。SRA01/04细胞转染siHOTAIR，CCK-8、EDU、Transwell迁移实验检测结果显示：与对照组相比，下调SRA01/04细胞HOTAIR的表达，细胞存活能力、增殖能力及迁移能力明显下降（P＜0.01），差异具有统计学意义。3.沉默HOTAIR的表达，抑制TGF-β2诱导的HLECs增殖、迁移、EMT过程，同时减少TGF-β2诱导的EMT相关转录因子的上调。倒置显微镜观察发现：与对照组相比（未被TGF-β2处理），TGF-β2处理的实验组细胞由原来的椭圆形变为长梭状，沉默HOTAIR以后，可以逆转细胞形态的变化。细胞免疫荧光法及western blot检测发现：经TGF-β2处理24h后，siNC+TGF-β2组细胞较siNC组组相比，E-cadherin、ZO-1表达降低，Vimentin及α-SMA表达增加（P＜0.01）；经siHOTAIR-3沉默后，siHOTAIR+TGF-β2组较siNC+TGF-β2组相比细胞E-cadherin、ZO-1表达增加，Vimentin及α-SMA表达降低（P＜0.01），差异具有统计学意义。western blot检测发现：siHOTAIR组较siNC组细胞Snail,Slug and ZEB1的表达明显下降（P＜0.01），差异具有统计学意义；siNC+TGF-β2组较siNC组细胞Snail,Slug and ZEB1的表达明显表达明显增加（P＜0.01），差异具有统计学意义；siHOTAIR+TGF-β2组较siNC+TGF-β2组细胞Snail,slug and ZEB1的表达明显下降（P＜0.01），差异具有统计学意义。CCK-8、EDU、划痕实验及Transwell迁移实验结果发现：siHOTAIR组较siNC组细胞存活能力、增殖能力、迁移能力降低（P＜0.05）；siNC+TGF-β2组较siNC组细胞存活能力、增殖能力、迁移能力降低明显增加（P＜0.01）；siHOTAIR+TGF-β2组较siNC+TGF-β2组细胞存活能力、增殖能力、迁移能力降低明显下降（P＜0.01），差异具有统计学意义。4.TGF-β/Smad通路主要信号分子参与TGF-β2诱导晶状体上皮细胞EMT过程，HOTAIR通过TGF-β/Smad通路在晶状体上皮细胞EMT过程中起作用。Western blot免疫印迹结果显示，与对照组相比，TGF-β2处理组SRA01/04细胞中磷酸化的Smad2、Smad3表达水平增加，P＜0.01，差异具有统计学意义。siHOTAIR组较siNC组SRA01/04细胞中pSmad2、pSmad3表达水平降低，经TGF-β2处理的siNC+TGF-β2组较siNC组SRA01/04细胞中pSmad2、pSmad3表达水平增加，经siHOTAIR-3沉默后，siHOTAIR+TGF-β2组较siNC+TGF-β2组pSmad2、pSmad3表达水平降低。　　结论：1.10ng/ml TGF-β2成功诱导人晶状体上皮细胞EMT细胞模型，细胞HOTAIR表达上调。2.沉默HOTAIR的表达抑制HLECs存活、增殖及迁移。3.HOTAIR参与TGF-β2诱导的HLECs存活、增殖、迁移及EMT过程，提示HOTAIR可能在后发性白内障（posterior capsule opacification，PCO）病理机制中扮演重要角色，但本研究缺乏体内研究，未来尚需进一步完善。4.HOTAIR通过TGF-β/Smad通路促进HLECs存活、增殖、迁移及EMT过程。

目录

前言

第一部分 TGF-β2促进人晶状体上皮细胞EMT的发生及上调lncRNA-HOTAIR的表达，探讨HOTAIR在人晶状体上皮细胞增殖、迁移中的作用

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3. 统计学方法

结果

1 TGF-β2诱导人晶状体上皮细胞发生EMT过程

2 TGF-β2促进人晶状体上皮细胞HOTAIR的表达，下调HOTAIR的表达，抑制HLECs的增殖、迁移过程

讨论

结论

第二部分 HOTAIR通过TGF-β/Smad通路促进晶状体上皮细胞增殖、迁移及EMT过程

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 统计学方法

结果

1. 沉默HOTAIR表达抑制TGF-β2 诱导的HLECs增殖、迁移及EMT过程

2. LncRNA HOTAIR通过促进 TGF-β/Smad 信号通路在 TGF-β2诱导的HLECs上皮间质转分化起作用

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

综述:长链非编码RNA在眼部纤维增生疾病中的作用

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