大脑杏仁核局部注射糖皮质激素对大鼠焦虑行为和学习记忆能力的影响及其可能机制

摘要

前言 糖皮质激素(glucocorticoid，GC)是由肾上腺皮质中束状带分泌的一类甾体激素。体内大多数组织存在糖皮质激素受体(glucocorticoid reccptor, GR)。GC是关键的应激激素，它的作用广泛而复杂。临床上经常将GC用于抗炎，抗毒，抗过敏和抗休克的治疗。然而临床调查显示，长期使用GC可以造成患者行为和认知能力等中枢神经系统功能的改变。大量使用GC还可以引起失眠，情绪激动或抑郁，记忆减退等症状，其相关机制目前还不清楚。 大量实验结果已经证实情绪调节以及与情绪相关的学习记忆功能是由大脑杏仁核(amygdala)所产生的。长期大剂量应用GC会引起大脑杏仁核神经元发生结构变化，如神经元树突网络重组，神经元再生减少等[1-5]。为了验证GC是否通过直接作用于大脑杏仁核来改变机体的情绪调控和学习记忆功能，我们以大鼠为动物模型，将corticorsterone(CORT,在大鼠中GC为CORT)局部微量注射于双侧大脑杏仁核，通过旷场试验，高架十字迷宫实验和恐惧条件反射实验等行为学实验方法来检测大鼠的行为有无改变。 此外，我们还探讨了脑原性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)与CORT诱导的大脑杏仁核功能改变的相关性。BDNF是中枢神经系统中调节细胞增殖、分化和存活的重要营养因子。它可以促进神经元树突增长，突触形成，参与突触的可塑性的调节[6-14]。有研究表明，杏仁核BDNF表达程度与焦虑行为和恐惧记忆能力相关[15]。但是CORT对BDNF的表达情况有何影响仍然不确定。Adzic等曾经发现应激造成CORT水平升高后，海马组织中BDNF表达减少;但是在相同的条件下大脑皮层BDNF表达却上调[17]。因此海马和大脑皮层中BDNF的表达，可能受到不同的机制调控。而在大脑杏仁核中CORT对BDNF的表达有何影响尚不清楚。为此我们应用免疫组化和ELISA等方法检测了局部注射CORT后，大脑杏仁核中BDNF的表达情况。 方法 一、杏仁核插管手术过程 将大鼠全身麻醉后，置于脑立体定位仪上，暴露前囟和颅骨，定位标记杏仁核。在标记过的杏仁核区域颅骨上钻孔，经钻孔处插入微量注射管。用牙科水泥将微量注射管与颅骨粘合以加固。动物单笼饲养，恢复一周后进行实验。 二、杏仁核局部微量注射 双侧杏仁核微量注射皮质酮(4μ g/μl共2μl)或生理盐水2μl。 三、开放旷场实验 将大鼠置于旷场的中心后开始进行摄像和计时。连续观察其运动情况5min，记录运动速度，运动距离，休息时间，沿边运动距离，中央运动距离等指标。 四、高架十字迷宫实验 实验开始时，将大鼠放入中心区，面对开放臂。记录5min内动物进入闭合臂和开放臂次数和停留时间。 五、恐惧条件反射实验 (1)环境适应:在给药处置前1天将大鼠放入实验笼中，播放1000z的声音20s，重复上述步骤累计5次。在整个实验过程中，实验者记录声音响起20s期间大鼠的不动时间。 (2)恐惧条件反射的建立:将给药处置后大鼠放入实验笼里，播放1000Hz的声音20s(条件刺激)，在声音结束前2s给予足底电击，足底电击与声音刺激同时结束。记录声音响起20s期间大鼠的不动时间。重复上述步骤累计7次。在整个实验过程中，实验者记录声音响起20s期间大鼠的不动时间。 (3)恐惧条件的消退:恐惧条件反射建立后1h，将大鼠从饲养笼放入实验笼中，播放1000z的声音20s，但不伴随足底电击，记录20s内大鼠的不动时间重复上述步骤累计15次。在整个实验过程中，实验者记录声音响起20s期间大鼠的不动时间。 六、免疫荧光 将冰冻切片在4℃条件下用丙酮固定10 min，加入山羊血清封闭液孵育1h，兔抗鼠BDNF抗体(1∶100)，4℃过夜。翌日切片经0.01M PBS(pH7.4)充分漂洗后，暗室内滴加山羊抗兔抗体IgG-FITC(1∶100)，室温孵育1h，充分清洗后，荧光显微镜下观察并摄片。 七、酶联免疫吸附(ELISA)测定BDNF浓度 杏仁核切割后称重，加入PBS(PH7.4)，匀浆，离心，收集上清。标准品稀释与加样;37℃温育60分钟，配液，彻底洗涤。加酶，37℃避光孵育30分钟，进行洗涤。37℃避光显色15分钟，每孔加终止液，终止反应。以空白调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行测定450nm波长吸光度（OD值）。 八、数据分析 所有实验数据均用均数±标准差（(x)±s）表示，各组均数间差异的比较应用t检验。 结果 一、大脑杏仁核局部注射CORT对大鼠焦虑行为的影响 应用CORT后可以明显增加大鼠的焦虑行为，表现为旷场试验中大鼠在中央区停留的时间明显减少，高架十字迷宫实验中大鼠进入开放臂次数和停留时间明显减少。 二、大脑杏仁核局部注射CORT对恐惧学习记忆能力的影响 在环境适应阶段，实验组和对照组大鼠都基本没有表现出木僵反应。在恐惧条件反射建立阶段，当声音刺激伴随有电击刺激后，两组大鼠都表现出木僵反应，不动时间百分率都迅速增加，但两组之间仍然没有显著性差异（P＞0.05，t检验）。在恐惧条件反射消退阶段，声音刺激不伴有电刺激后，两组大鼠随着声音刺激的增多，木僵反应逐渐消退，但实验组大鼠木僵反应消退的速度明显减缓，两组之间有显著性差异（P＜0.05，t检验）。 三、大脑杏仁核局部注射CORT对BDNF表达的影响 (1)免疫荧光染色的结果 应用CORT后，实验组的大鼠杏仁核中的BDNF水平明显升高。两组之间具有显著性差异(P＜0.01)。 (2)ELISA法检测结果 应用CORT后，实验组的大鼠杏仁核中的BDNF水平明显升高。两组之间具有显著性差异(P＜0.05)。 结论 本实验通过大脑内局部微量注射的方法，证实了CORT作用于杏仁核后可以引起大鼠产生焦虑行为，并且可以阻碍其对已形成的恐怖条件反射的消退。这些情感和记忆行为的异常可能与CORT诱导的BDNF表达增强有关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法

三、统计学处理

实验结果

1、大脑杏仁核局部注射CORT对大鼠焦虑行为的影响

2、大脑杏仁核局部注射CORT对恐惧条件反射的影响

3、大脑杏仁核局部注射CORT对BDNF表达的影响

讨论

1、GC与焦虑抑郁行为的关系

2、GC与恐惧学习记忆的关系

3、BDNF与焦虑行为和恐惧学习记忆的关系

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 糖皮质激素和脑源性神经营养因子对中中枢神经系统的影响

致谢

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