ChIP-chip技术筛选胃癌相关抑制基因及其表遗传学调控机制的研究

摘要

前言：
　　胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一。在世界范围内，在男性中其死亡率居癌症死因的第二位，而在女性中其死亡率居癌症死因第三位。我国胃癌发病率居各类肿瘤的首位，约42％的胃癌病人出现在我国。大部分病人诊断时已处于进展期，预后不良。因此，需要对胃癌发生、发展的分子学机制进行进一步的研究。
　　近年来，越来越多的证据证实表遗传学的改变在胃癌的发生、发展中起到至关重要的作用。这些表遗传学包括组蛋白修饰、DNA甲基化是不依赖基因的突变和缺失而导致基因失活的重要机制。胃癌相关抑制基因的失活往往伴随着异常的组蛋白修饰、DNA甲基化。其中，组蛋白修饰被称为“组蛋白密码”可以影响染色体的结构和基因的转录，在肿瘤的形成中起到很关键的作用。组蛋白赖氨酸的甲基化和乙酰化是两种研究最为透彻的组蛋白修饰方式，被认为参与多种分子生物过程的调控，如基因的激活和失活，X-染色体的活化，DNA的修复以及细胞周期的调控等。其中，高水平的H3K9乙酰化和H3K4三甲基化被认为可以激活基因转录，而高水平的H3K9三甲基被认为与基因的失活相关。
　　在后基因时代，高通量技术的出现使在基因组水平上对肿瘤细胞进行分析成为可能。染色质免疫沉淀结合芯片(ChIP-chip)已经被广泛用于基因组水平肿瘤的研究。在本项研究中，我们利用ChIP-chip技术筛选胃癌中的抑制基因并对其表遗传学调控机制及抑癌基因功能进行了深入的研究。
　　目的：
　　本研究旨在利用ChIP-chip技术筛选胃癌相关抑制基因，阐明其表遗传学改变情况，并且利用表遗传学调控相关药物进行干预，探讨其表遗传学调控的机制。(1)采用Roche-NimbleGen的Human3×720K RefSeq Promoter Array筛选H3K9Me3 ratio值/H3K9Ac ratio值＞2的基因及H3K9Me3 ratio值/H3K4Me3 ratio值＞2的基因。并选取4个候选基因利用ChIP-qPCR实验验证ChIP-chip结果。(2)分析3个候选基因在胃癌细胞中的mRNA表达及启动子区DNA甲基化状态。进一步通过体外实验研究胃癌细胞株在表遗传学调控相关药物的干预下3个候选基因的表达是否可以逆转，由此探讨表遗传学调控相关药物在治疗胃癌的临床应用价值。(3)通过体外构建3个候选基因之一的PSD基因表达降低的胃癌细胞株，观察对其增殖和侵袭能力的影响，进一步论证其抑癌基因功能及作用机制。
　　方法：
　　一、实验对象
　　2009年4月～2010年6月中国医科大学肿瘤研究所行根治性手术治疗的胃癌患者癌和癌旁配对组织共40例;人胃癌细胞株SGC7901、MKN45、 BGC823、AGS和永生化正常人胃细胞株GES1。
　　二、实验方法
　　1、细胞培养:GES1、SGC7901、MKN45、BGC823和AGS按常规培养。DNA甲基化酶抑制剂(5-Aza-2-deoxycytidine)和/或组蛋白去乙酰化酶抑制(TrichostatinA)对胃癌细胞株进行药物干预及siRNA。
　　2、ChIP-chip技术筛选胃癌相关抑制基因。
　　3、ChIP-qPCR实验验证芯片筛选基因结果的可靠性。
　　4、MSP法检测相关抑制基因启动子DNA甲基化状况。
　　5、qRT-PCR检测相关抑制基因mRNA在细胞和组织水平的表达。
　　6、CCK-8法检测药物干预及siRNA前后胃癌细胞增值力的变化。
　　7、细胞划痕实验及Transwell侵袭实验检测药物干预及siRNA前后胃癌细胞迁移及侵袭能力的变化。
　　8、Western blot检测胃癌旁和癌组织中PSD蛋白表达含量。
　　结果：
　　第一部分应用ChIP-chip技术筛选胃癌相关抑制基因的研究
　　ChIP-chip结果显示134个基因的H3K9Me3 ratio值/H3K9Ac ratio值＞2以及46个基因的H3K9Me3 ratio值/H3K4Me3 ratio值＞2。4个筛选基因进行ChIP-qPCR检测，结果与芯片分析结果相一致。
　　第二部分胃癌细胞中筛选基因PSD、SMARCC1及Vps37A的表达及其表遗传学调控机制
　　1、qRT-PCR结果显示，在胃癌细胞中的筛选基因PSD、SMARCC1表达水平均低于胃正常粘膜上皮细胞。然而，筛选基因Vps37A表达水平在胃癌细胞与胃正常粘膜上皮细胞之间没有显著差异。
　　2、MSP结果显示，在胃癌细胞中的PSD基因DNA启动子区表现为甲基化，SMARCC1基因表现为部分甲基化。然而，Vps37A基因表达为非甲基化。
　　3、表遗传学调控相关药物（5-Aza-2-deoxycytidine、Trichostatin A）对胃癌细胞MKN45细胞的增殖、迁徙及侵袭能力有明显影响。并且可以逆转PSD、SMARCC1基因DNA启动子区的甲基化状态，从而恢复PSD、SMARCC1基因mRNA的表达。但对Vps37A基因mRNA的的表达无明显影响。
　　第三部分 PSD基因抑癌作用机制的探讨以及其临床意义
　　1、胃癌细胞中PSD基因表达水平明显低于GES1细胞，DNA甲基化及异常组蛋白修饰共同调控PSD基因表达。
　　2、筛选PSD相对高表达的胃癌细胞株SGC7901采用siRNA技术下调其表达后，胃癌细胞株SGC7901的增殖力、侵袭力均明显增强。
　　3、下调PSD基因表达后，胃癌细胞SGC7901的细胞增殖、迁徙及侵袭能力明显提高。
　　4、检测筛选基因调控的细胞因子（Caspase3、Caspase7）的蛋白表达水平在转染后明显下调。
　　5、胃癌组织中PSD基因mRNA及蛋白表达水平明显低于癌旁组织，并与肿瘤分化及淋巴结转移相关，但未发现与其他临床病理学特征具有相关性。
　　结论：
　　1、启动子芯片结合芯片技术(ChIP-chip)可以高通量的筛选胃癌中受表遗传学机制调控的抑癌基因。
　　2、在胃癌细胞中，抑癌基因PSD、SMARCC1的表达下调是组蛋白修饰和DNA甲基化共同作用的结果。
　　3、PSD基因在胃癌中起到抑癌基因功能，其作用机制可能与诱导胃癌细胞凋亡有关。
　　4、PSD基因在胃癌组织中表达下调主要受表遗传学机制调控，并为表遗传调控相关药物在胃癌治疗中的应用提供新的靶点。
　　5、PSD基因及蛋白在胃癌组织中表达下调，且与胃癌分化程度及胃癌淋巴结转移密切相关，可能成为胃癌防治及预后判断的分子标准物。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 应用ChIP-chip技术筛选胃癌相关抑制基因的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 胃癌相关抑制基因PSD、SMARCC1及Vps37AmRNA表达的表遗传学调控机制的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 PSD基因在胃癌中的抑癌作用及其临床意义的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

本研究创新的自我评价

综述 ChIP-chip技术在肿瘤研究中的应用进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简历