miR-27b在胃癌中的生物学功能及表遗传学调控机制研究

摘要

前言:肿瘤目前已经成为了常见病多发疾病。据估算，在世界范围内最常见的恶性肿瘤中，胃癌排名第四，而在肿瘤引起的相关死亡中胃癌排名第二。研究表明，异常的miR-27b表达发生在多种肿瘤中，包括胃癌。然而，miR-27b在胃癌中调控机制及其生物学功能和临床意义尚且未知，因此，在本研究中，我们对miR-27b在胃癌中的表达情况，以及其miR-27b对胃癌细胞生物学行为的影响进行了研究，在此基础上，我们从表遗传学角度对miR-27b在胃癌细胞的异常表达进行了深入分析。
　　材料和方法:1.80对胃组织样本，包括80例胃癌组织和配对的癌旁正常组织，被用于本实验研究。他们来自于2013-2014年在中国医科大学附属第四医院被确诊为胃癌的患者，这些患者在手术之前未进行放化疗等任何其他治疗手段。2.所有组织进行H&E染色处理并进行组织学诊断。3.四株胃癌细胞BGC-823，MGC-803，SGC-7901，MKN-45和一株正常胃粘膜上皮细胞GES-1。所有的细胞均培养在含10％胎牛血清的细胞培养基中，并被放入含5％二氧化碳的37℃的恒温箱中进行培养。4.Trizol试剂被用在本实验中对全基因组RNA进行提取。miR-27b在胃癌细胞系和胃癌组织中的表达量通过实时定量RT-PCR进行定量检测。4.在转染试剂的作用下，miR-27b低表达的胃癌细胞分别被转入miR-27b mimics、miR-27b Inhibitor、scramble，或者未被转染。细胞增殖、转移、侵袭和细胞凋亡实验被用来研究miR-27b对胃癌细胞恶性生物学行为的影响。5.在线生物预测软件预测miR-27b的可能靶基因，通过查阅文献进一步筛选，并利用双荧光素酶基因报告实验进行验证。Western blot检测靶基因在胃癌组织和细胞中的蛋白表达情况。6.去甲基化药物5-AZA-CdR and/or TSA处理胃癌细胞。MSP进行检测胃癌细胞系和胃组织中miR-27b基因启动子区CpG岛甲基化水平。6.利用SPSS17.0软件对胃癌组织及癌旁正常组织中miR-27b的表达水平进行统计学分析。主要统计方法采用t检验（或者方差分析），P＜0.05表示差异有统计学意义，P＞0.05表示差异无统计学意义。
　　结果:1.与正常胃粘膜上皮细胞相比，miR-27b在胃癌细胞株(MKN-45，SGC-7901，BGC-823，MGC-803)中表达水平明显降低。同时，我们发现miR-27b在胃癌组织中的表达水平相比在癌旁正常组织中的表达水平更低。2.表达miR-27b可以抑制胃癌细胞增殖、侵袭、转移并诱导细胞凋亡。下调miR-27b表达促进胃癌细胞增殖、侵袭并抑制胃癌细胞凋亡。3.通过甲基化特异性PCR检测发现，与正常胃癌粘膜上皮细胞相比，胃癌细胞中miR-27b启动子区CpG岛呈现异常高甲基化状态，在胃癌细胞系MKN-45中尤为明显。并且，我们也发现，在miR-27b低表达的胃癌组织中miR-27b启动子区CpG岛呈现出比miR-27b高表达的胃癌组织中更高的甲基化水平。更重要的是，我们发现，miR-27b启动子区的这种高甲基化状态可以被去甲基化药物5-Aza-dC部分逆转。4.miR-27b通过与GSPT13'UTRs结合而抑制其蛋白表达。结论:我们的研究表明，异常低表达的miR-27b在胃癌中扮演了肿瘤抑制基因的作用，并且miR-27b低表达部分原因是其启动子区CpG岛高甲基化;这说明miR-27b可能具有发展为胃癌潜在的治疗靶标。
　　结论:我们的研究表明，下调表达的miR-27b在胃癌中扮演了抑癌基因的角色，它的低表达部分是由于其启动子区CpG岛高甲基化，这些结果表明miR-27b可能具有发展为胃癌治疗靶点的潜能。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

5 结论

创新性的自我评价

参考文献

综述 miR-27b在肿瘤中的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历