4Fe-4S簇结构域在ABCE1与Beta-actin相互作用以及调控肺腺癌细胞体外生物学功能中的意义

摘要

目的:
　　ABCE1基因全名ATP结合盒转运子E1，又名RLI或HP68，是ATP结合盒超家族E亚组1号成员，也是E亚组唯一成员。基因位于常染色体4q31，基因编码区长1800bp，表达蛋白因其核糖核酸酶L(RNase L)的抑制因子(RLI)作用而被发现，又因蛋白由599个氨基组成，分子量约68KDa，被称为HP68。ABCE1蛋白由四个部分组成，两个核苷酸结合域NBD1和NBD2，一个Hinge域和两个4Fe-4S簇结构域。ABCE1缺乏作为跨膜转运蛋白所必须的TMD结构，是ABC家族唯一不具备跨膜转运能力，但具有两个其他家族成员所没有的4Fe-4S簇结构域的成员。
　　在真核生物翻译过程中，ABCE1与真核生物翻译起始因子eIF2和eIF5相互作用，启动了翻译的起始过程;翻译完成后，ABCE1与翻译终止因子eRF1相互作用，调控了翻译中止和核糖体再循环。ABCE1调控干扰素依赖的2-5A/RNase L通路，ABCE1的上调会抑制该通路的抗病毒作用的功能。ABCE1与HIV病毒的Gag蛋白结合，共同参与了HIV病毒壳的组装。在肿瘤研究领域发现人肺腺癌及转移淋巴结组织中ABCE1mRNA和蛋白水平高于癌旁组织和正常肺组织。干扰H446人小细胞肺癌细胞株的ABCE1基因表达会降低细胞的侵袭、迁移和增殖能力。
　　本课题组前期研究发现在肺癌细胞中ABCE1与Beta-actin(β-actin)相互作用，在LTEP-a-2人肺腺癌细胞株中上调ABCE1后β-actin呈现出高表达现象，细胞的增殖和侵袭能力增强。
　　β-actin是脊椎动物肌动蛋白的三种亚型之一，存在于大多数细胞中，是细胞骨架的主要成分，调节细胞的运动性。现已发现β-actin的高表达与肺癌、结肠癌、乳腺癌和白血病等多种恶性肿瘤相关。
　　ABCE1是ABC家族中唯一的铁硫蛋白，其4Fe-4S簇结构域是否参与了ABCE1与β-actin的相互作用环节，以及是否参与了调控肿瘤迁移和增殖等生物学功能需要进一步深入研究。
　　方法:
　　通过RNA提取、目的基因扩展、酶切和连接等方法构建pGEX-4T-1-ABCE1和pGEX-4T-1-△ABCE1质粒。pGEX-4T-1-ABCE1质粒连接了ABCE1全长基因;pGEX-4T-1-△ABCE1质粒连接了敲除4Fe-4S簇结构域编码基因片段的ABCE1基因。经质粒测序检测构建质粒序列有无错误。将这两种质粒转化并诱导感受态细胞，进一步通过GST重组蛋白纯化技术获得提纯的GST-ABCE1和GST-△ABCE1（4Fe-4S簇结构域敲除）蛋白。ATP酶活性检测评估其生物学活性。通过GSTpull-down技术检测两种蛋白与β-actin纯化蛋白在体外环境下相互作用的能力。评价ATP在相互作用过程中的意义。
　　构建上调ABCE1和4Fe-4S簇结构域敲除ABCE1基因(△ABCE1)的慢病毒包装载体，感染A549人肺腺癌细胞株，获得上调ABCE1和△ABCE1基因的细胞株。通过Transwell小室实验和划痕实验检测细胞的迁移能力。通过MTT实验和平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力。
　　结果:
　　成功构建了pG EX-4T-1-ABCE1和pGEX-4T-1-△ABCE1质粒，经测序检测无误。将质粒转化入感受态细胞BL21(DE3)pLysS中，IPTG诱导表达GST-ABCE1和GST-△ABCE1蛋白。蛋白提取和GSH树脂纯化，获得提纯的GST-ABCE1和GST-△ABCE1蛋白。ATP酶活性检测证实了两种重组蛋白具备生物学活性。GST pull-down实验进一步证实了ABCE1与β-actin纯化蛋白在体外环境下可以发生特异性结合，对照组中GST标签蛋白不能与β-actin发生结合，GSH树脂也不能够与β-actin发生结合。重复实验过程中去除了ATP的存在，发现ABCE1无法与β-actin结合。△ABCE1不能与β-actin发生结合。
　　成功构建了上调ABCE1基因和4Fe-4S簇结构域敲除ABCE1基因的慢病毒包装载体。通过慢病毒载体感染技术获得了上调ABCE1和4Fe-4S簇结构域敲除ABCE1基因的A549人肺腺癌细胞株。经Western blot实验验证感染细胞株中目的蛋白表达上调显著高于对照组细胞。上调ABCE1基因的A549细胞迁移能力和增殖能力显著高于上调△ABCE1基因的A549细胞、空载体感染A549细胞和未经干预的A549细胞。
　　结论:
　　1、ABCE1蛋白可以在体外环境下与β-actin发生特异性结合，该结合过程需要ATP参与，4Fe-4S簇结构域是ABCE1蛋白参与该结合过程的关键结构域。
　　2、4Fe-4S簇结构域参与了ABCE1上调A549人肺腺癌细胞株侵袭和增殖的功能。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：ABCE1与Beta-actin体外环境下相互作用的验证以及相互作用机制的研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

5 结论

附图

第二部分：4Fe-4S簇结构域在ABCE1基因调节肺癌细胞迁移和增殖能力过程中的意义研究

1 前言

2 材料与方法

3 结果

讨论

结论

附图

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

致谢

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