基于蛋白质组学技术对先天性心脏畸形产前诊断蛋白质标志物的筛查研究

摘要

目的：
　　先天性心脏畸形(congenital heart defects，CHDs)是最常见的先天畸形之一，发病率约为活产婴儿的1.9％-7.5％，在死产或自然流产的胎儿中比例更高。我国每年约有10万-15万CHDs患儿出生，为新生儿时期的主要死亡原因之一，对患儿及其亲属乃至整个社会都造成沉重的负担。
　　因此，CHDs的早期诊断以及发生机制的研究，对于开展CHDs的预防或产前干预，具有十分重要的意义。目前，临床工作中尚没有产前筛查CHDs的分子标志物，CHDs的产前诊断主要依赖于产前超声检查。然而，胎儿超声心动图仅仅在一些产前诊断中心得以开展，只有少部分高危妊娠孕妇能够得到检查，并且诊断准确率受操作者主观诊断能力的影响较大。而且超声对CHDs检出时间较晚，许多孕妇发现CHDs时孕周较大，且很多复杂心脏畸形是生后手术难以矫正的。在孕妇的外周血中筛选出畸形相关标志物被公认为产前诊断的最理想方式。首先，它可以避免传统的有创产前诊断方法（如羊水穿刺、脐血穿刺等）带来的风险;其次，它可以作为一种筛查手段在基层医院得以开展，结果异常的建议进一步做超声心动图检查;再次，这种检查手段有可能早期发现CHDs，这为早期临床决策及靶向治疗提供了重要依据。
　　以蛋白质组学为基础，在孕妇的血清、羊水以及代谢产物中筛选出妊娠相关分子标志物方面的研究在过去几年中取得了显著进展。目前，蛋白质组学技术在产前主要被应用于染色体异常胎儿标志物的筛查，对胎儿结构畸形产前标志物筛查的研究甚少。本研究中，我们结合了非靶向蛋白质组学技术——同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ)与靶向蛋白质组学技术——多反应监测质谱技术(multiple reaction monitoring massspectrometry，MRM-MS)比较CHD孕妇与正常孕妇外周血中的蛋白表达差异，并利用经典的ELISA技术进行大样本验证，筛选出CHD孕妇产前无创诊断的蛋白质标志物。
　　方法：
　　一、孕妇血清与胎儿心脏标本收集
　　1、共收集正常孕妇、CHD胎儿孕妇、其它结构畸形胎儿孕妇以及正常孕龄期妇女外周血血清420例。
　　(1) CHD组:2011年9月至2014年12月于中国医科大学附属盛京医院产前诊断中心诊断为胎儿单纯先天性心脏畸形孕妇外周血血清180例，孕周22-26周;
　　(2)正常对照组:选择孕龄和年龄均与CHD组相匹配（22-26周）的正常孕妇90例作为对照组;
　　(3)其它孕周组:选择年龄与对照组相匹配的正常孕妇不同孕周外周血血清80例，其中8-10周、16-19周、32-34周、38-40周各20例。
　　(4)未孕组:年龄与对照组相匹配的孕龄期妇女（既往身体健康，无妊娠史）外周血血清20例。
　　(5)16-19周CHD组:在16-19周诊断为CHDs的孕妇外周血血清10例。
　　(6)其它系统畸形:选取周龄、孕妇年龄与对照组相匹配的单纯唇腭裂、单纯神经管畸形、单纯染色体异常、其它单一系统畸形（单纯消化系统畸形4例、单纯泌尿系统畸形4例、单纯肢体畸形2例）孕妇外周血血清各10例。
　　所有孕妇均为单胎妊娠，既往身体健康，不合并妊娠高血压、糖尿病等其它系统疾病。孕妇均签署知情同意书，于清晨7:00-8:00抽取空腹静脉血5ml，4℃静置1h，3000 rpm离心10min，取上清，每管200ul分装，-80℃保存。
　　2、共收集胎儿心脏组织8例
　　(1)CHD组:22-26周CHD胎儿心脏大体标本4例，
　　(2)正常对照组:选择与CHD组孕周、孕妇年龄、胎儿性别相匹配的心脏发育正常的胎儿心脏组织4例。所有心脏组织-80℃保存。
　　二、同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)对差异蛋白质的筛选
　　不同亚型的先心病可能呈现不同的蛋白质表达谱，因此在标志物的发现阶段，我们设置了4个先心病亚型组和一个对照组。这样既可以筛选出先心病特异的标志物，也可以观察到不同亚型之间表达是否有差异，避免不同亚型先心病混合后对某些蛋白质表达的掩盖。4组先心病样本中，每组10例样本混合，前3组是3种比较常见的先心病（法洛氏四联征，室间隔缺损，共同动脉干），另外一组是几种少见的不同亚型先心病的混合。对照组为10例正常孕妇血清混合。混合后的样本用Proteo miner试剂盒进行血清高丰度蛋白去除，提取蛋白;对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理，打开二硫键以便后续步骤充分酶解蛋白;用Brand ford法进行蛋白的浓度测定;SDS（十二烷基磺酸钠）-PAGE;取等量蛋白Trypsin酶解;用iTRAQ试剂标记肽段;将标记后的肽段进行等量混合;对混合后的肽段使用强阳离子交换色谱（Strong Cation Exchange Choematography，SCX）进行预分离;最后进行液相串联质谱(liquid chromatography coupled with tandemmassspectrometry，LC-MS/MS)分析。
　　三、生物信息学分析及候选标志物的预测
　　1、生物信息学分析
　　应用Mascot检索软件、GO注释、COG注释、Pathway代谢通路注释、多样品间表达模式聚类分析等生物信息学方法对差异蛋白进行功能分析。
　　2、候选标志物的选择标准
　　(1)在CHD与正常对照组血清之间差异显著，表达差异在1.5倍以上。
　　(2)差异重复性好，在不同亚型CHD中稳定表达。
　　(3)质谱检测信号强，信噪比高。
　　(4)功能检索提示该蛋白应具有较重要的生理功能，在胚胎发育及代谢过程中具有一定的生物学作用。
　　四、多反应监测质谱技术(MRM-MS)对差异蛋白质的验证
　　1、确定目标蛋白质
　　根据生物信息学结果确定目标蛋白质，并根据目标蛋白的已知信息预测目标蛋白的代表肽段。
　　2、预测可行的transitions。
　　在选择肽段的transition时，首要条件要保证所选肽段在样本背景中能唯一代表目标蛋白。同时，其它选择条件如肽段长度一般为6-15氨基酸、母离子+2或+3价，m/z小于1000，子离子为y离子、肽段无转录后或化学修饰、无漏切位点等都是选择最优的transitions需要综合考虑的条件。
　　结果：
　　一、iTRAQ技术对差异蛋白质的鉴定
　　应用iTRAQ定量蛋白质组学方法鉴定差异蛋白，在孕妇外周血血清中共鉴定到蛋白质606个，表达差异在1.5倍以上的蛋白质47个，其中23个表达上调，24个表达下调，这些差异蛋白部分在所有亚型组中均差异表达，部分在一种或几种亚型组中差异表达。这47个差异蛋白的功能主要涉及到应激反应、脂类代谢、发育过程、细胞构成等生物过程。
　　二、MRM-MS技术对差异蛋白质的验证
　　在iTRAQ技术鉴定得到的47种差异蛋白中，LMNA，TPM4，FLNA，MYH9，APOC1，PF4V1，SAA2，SAA4，HP，ACTG1和NRX2B11种蛋白在3种以上亚型组中均差异表达，我们应用MRM-MS技术对这11种蛋白进行进一步的验证，这样得到的标志物更有希望诊断不同亚型先心病。
　　应用MRM技术成功对11种蛋白质中的9种进行相对定量，另外两种蛋白（FLNA和ACTG1）因为信号强度较低不能进行准确定量。验证实验在一个独立样本中完成，CHD组22例，对照组20例，每个样品重复检测3次。MRM结果显示CHD组中LMNA，TPM4明显下调，APOC1表达明显上调，差异均具有统计学意义，这三种蛋白的验证结果与iTRAQ蛋白质组学筛选的结果一致。MYH9，PF4V1，HP，SAA4在MRM结果中差异不明显;SAA2，NRX2B在CHD组中表达明显下调，这与iTRAQ筛选得到的结果相反。
　　三、ELISA技术对候选标志物的验证
　　我们应用ELISA技术对MRM进一步筛选得到的候选标志物在一个独立的相对较大的样本中进行进一步的验证，MRM技术没能准确定量的两种蛋白质FLNA和ACTG1也被纳入ELISA的验证实验。
　　结论：
　　1、本实验首次将定量蛋白质组学iTRAQ技术应用于先天性心脏畸形产前诊断标志物的研究当中。我们应用该技术成功获得了CHD胎儿孕妇血清差异表达蛋白质谱。
　　2、我们结合靶向蛋白质组学MRM-MS技术和经典ELISA技术对差异蛋白进行验证，得到了一组蛋白质标志物(LMNA，FLNA，TPM4，ACTG1)在产前诊断CHDs中具有较高的敏感性和特异性。这些蛋白质均为细胞骨架蛋白，提示这些骨架蛋白在心脏发育过程中可能发挥了重要作用。
　　3、LMNA作为单独的诊断标志物具有最好的诊断价值，LMNA在正常孕妇外周血中的表达随孕周的改变而变化，提示LMNA是一种妊娠相关的标志物，而且在CHD胎儿心脏组织中的表达明显降低，提示其在CHDs的胚胎发生过程中具有一定作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词

论文一 基于iTRAQ技术对先天性心脏畸形胎儿孕妇外周血清差异表达蛋白筛选

前言

材料与方法

实验结果

讨论

论文二 先天性心脏畸形产前诊断蛋白质标志物的验证与诊断评价

前言

材料与方法

实验结果

讨论

论文三 核纤层蛋白A对先天性心脏畸形的产前诊断

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

研究创新性的自我评价

参考文献

综述 蛋白质组学技术在产前诊断中的应用

在学期间科研成绩

致谢

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