MiR-3620-3p靶向调控lncRNA-TUBB2A抑制胃癌细胞增殖、侵袭的机制研究

摘要

目的：
　　MicroRNA(miRNA)是一类长度约为20-24nt的非编码单链小分子RNA，通过与靶基因mRNA的3'端非翻译区互补结合，降解mRNA或抑制其翻译，参与调控发育、分化、增殖和凋亡等重要的生命过程。更为复杂的是单一miRNA可能调控多个靶基因，而单一基因表达可能受多个miRNAs调控。最近，国内外学者相继发现多个miRNAs可通过调控单一或多个靶基因促进或抑制胃癌细胞增殖、侵袭转移。LncRNA是一种转录本长度超过200nt的非编码RNA，其本身缺乏明显的开放阅读框，定位于内含子和基因间区域，由RNA聚合酶Ⅱ转录而来，不具备编码蛋白质的功能。但是其在生物学各个层面都发挥着重要作用。最近的研究发现，miRNA与lncRNA可以相互调控。例如，miR-141能够特异性地结合到lncRNA-HOTAIR上，引起HOTAIR表达下降。此外，肝癌中过表达的miR-29a通过调控DNA甲基转移酶1和3（DNMT1和DNMT3）使lncRNA-MEG3表达增加。第二军医大学的孙树汉课题组观察到TGF-β激活的lncRNA-ATB在肝癌中上调，并与预后不良有关。LncRNA-ATB通过竞争性结合miR-200家族上调ZEB1和ZEB2，进而诱导EMT和侵袭。基于此，本文应用芯片技术及生物信息学分析，发现与胃癌发生、发展相关的细胞周期调控、细胞粘附、细胞紧密连接等信号通路上存在复杂的网络调控。其中，miR-3620-3p对多个lncRNAs(MEG3，AC000120.7，HCG9，RP11-731K22.1，LOC84740，AK127460，XLOC_007604,NCRNA00105，CTB-114C7.3，TUBB2A，CYP4F43P，CTB-49A3.5）的调控颇受关注。
　　本研究拟明确miR-3620-3p在胃癌中的异常表达情况，探讨其与胃癌发生、发展及预后的关系。进一步筛选出miR-3620-3p下游调控的lncRNAs，明确其作用机制。
　　方法：
　　一、MiR-3620-3p在人胃癌组织中的表达
　　1、应用实时定量PCR技术检测miR-3620-3p在胃癌及其癌旁非癌组织中的表达。
　　2、采用Wilcoxon符号秩检验对胃癌组织及癌旁非癌组织的miR-3620-3p表达水平进行了比较。
　　3、采用非参数检验方法分析miR-3620-3p相对表达水平与临床病理资料的联系，两组比较采用Manner-Whitney U检验，多组比较采用Kruskal-Wallis H检验。
　　4、使用Kaplan-Meier法计算总生存率，并使用log-rank检验对差异进行评估。
　　二、筛选miR-3620-3p下游调控的lncRNAs
　　1、合成miR-3620-3p模拟物及其阴性对照，瞬时转染胃癌细胞系SGC-7901，使其过表达。
　　2、应用实时定量PCR技术检测miR-3620-3p过表达后，相关lncRNAs的表达变化。
　　三、构建lncRNA-TUBB2A过表达载体
　　1、应用分子克隆、酶切、连接、转化等方法构建lncRNA-TUBB2A过表达载体。
　　2、重组质粒测序验证并大量抽提。
　　四、MiR-3620-3p靶向调控lncRNA-TUBB2A的研究
　　1、应用RNAhybrid预测miR-3620-3p与lncRNA-TUBB2A的结合位点。
　　2、构建荧光素酶报告基因，经酶切、连接、转化、酶切验证及测序验证载体构建结果。
　　3、应用双荧光素酶报告基因检测分析miR-3620-3p是否靶向调控lncRNA-TUBB2A。
　　五、MiR-3620-3p靶向调控lncRNA-TUBB2A对胃癌细胞增殖、侵袭、细胞周期及凋亡的影响
　　1、在转染lncRNA-TUBB2A，miR-3620-3p+lncRNA-TUBB2A，空载pcDNA3.1的细胞中，应用CCK-8检测miR-3620-3p、lncRNA-TUBB2A对胃癌细胞增殖的影响。应用Transwell检测miR-3620-3p、lncRNA-TUBB2A对胃癌细胞侵袭的影响。
　　2、在转染lncRNA-TUBB2A，miR-3620-3p+lncRNA-TUBB2A，空载pcDNA3.1的细胞中，分别应用PI染色及AnnexinⅤ-APC/PI检测miR-3620-3p、lncRNA-TUBB2A对胃癌细胞周期及凋亡的影响。
　　结果：
　　一、胃癌组织中miR-3620-3p异常低表达
　　在62例组织中，胃癌组织的△CT值为11.33±2.94，非癌组织的△CT值为9.96±3.43(P＜0.001)。与非癌组织相比，miR-3620-3p在66％(41/62)的胃癌组织中下调。非参数检验统计结果显示，miR-3620-3p的异常表达与性别、年龄、肿瘤大小、大体分型、组织学分型、TNM分期及淋巴管浸润等因素无关。使用Kaplan-Meier法计算总生存率，并使用log-rank检验对差异进行评估，我们发现miR-3620-3p的异常表达与胃癌预后无显著关联(P=0.880)。
　　二、在胃癌细胞中，miR-3620-3p可以显著下调lncRNA-TUBB2A
　　根据前期芯片筛查结果，我们在SGC-7901中，分别转染miR-3620-3p模拟物及其阴性对照。针对候选的lncRNAs(MEG3，AC000120.7，HCG9，RP11-731K22.1，LOC84740,AK127460，XLOC_007604，NCRNA00105,CTB-114C7.3，TUBB2A，CYP4F43P，CTB-49A3.5)设计定量PCR引物，检测过表达miR-3620-3p后，上述lncRNAs的表达变化。结果发现过表达miR-3620-3p后，lncRNA-TUBB2A（0.675±0.118）表达下降最为明显。
　　三、MiR-3620-3p靶向调控lncRNA-TUBB2A
　　应用RNAhybrid预测miR-3620-3p与lncRNA-TUBB2A有5个结合位点，双荧光素酶报告基因检测结果显示，与对照组相比，miR-3620-3p+psiCHECK-2-TUBB2A组荧光素酶活性受到明显的抑制（0.59±0.07，P＜0.05）。MiR-3620-3p可通过与作用于其靶基因类似的机制对lncRNA-TUBB2A起负性调控作用。
　　四、MiR-3620-3p靶向调控lncRNA-TUBB2A抑制胃癌细胞增殖
　　在转染lncRNA-TUBB2A，miR-3620-3p+lncRNA-TUBB2A，空载pcDNA3.1的细胞中，应用CCK-8检测，对比转染空载pcDNA3.1的细胞，过表达lncRNA-TUBB2A的细胞增殖能力显著提高(P＜0.05)。但是，加入miR-3620-3p模拟物共转染之后，lncRNA-TUBB2A促进细胞异常增殖的能力被部分逆转(P＜0.05)。
　　五、MiR-3620-3p靶向调控lncRNA-TUBB2A抑制胃癌细胞侵袭
　　在转染lncRNA-TUBB2A，miR-3620-3p+lncRNA-TUBB2A，空载pcDNA3.1的细胞中，应用Transwell实验检测miR-3620-3p、lncRNA-TUBB2A对胃癌细胞侵袭的影响，结果显示，过表达lncRNA-TUBB2A的细胞侵袭能力较对照组明显提高（52.54±2.55 vs22.08±3.09，P＜0.05）。但是，加入miR-3620-3p模拟物共转染之后，lncRNA-TUBB2A促进细胞异常侵袭的能力被部分逆转(P＜0.05)。
　　六、MiR-3620-3plncRNA-TUBB2A对胃癌细胞周期及凋亡的影响
　　在转染lncRNA-TUBB2A，miR-3620-3p+lncRNA-TUBB2A，空载pcDNA3.1的细胞中，应用流式细胞仪检测miR-3620-3p、lncRNA-TUBB2A对胃癌细胞周期的影响，结果显示，miR-3620-3p、lncRNA-TUBB2A对胃癌细胞周期无明显调控作用。应用AnnexinⅤ-APC/PI检测细胞凋亡情况，发现lncRNA-TUBB2A对细胞凋亡无影响。但共转染miR-3620-3p后，发现miR-3620-3p促进了细胞凋亡(P＜0.05)。
　　结论：
　　1、与非癌组织相比，miR-3620-3p在胃癌组织中明显低表达。MiR-3620-3p的相对表达水平与临床病理特征及预后无关。
　　2、在胃癌细胞中，miR-3620-3p可以显著下调lncRNA-TUBB2A。
　　3、MiR-3620-3p可通过与作用于其靶基因类似的机制对lncRNA-TUBB2A起负性调控作用。
　　4、MiR-3620-3p靶向调控lncRNA-TUBB2A抑制胃癌细胞增殖。
　　5、MiR-3620-3p靶向调控lncRNA-TUBB2A抑制胃癌细胞侵袭。
　　6、MiR-3620-3p、lncRNA-TUBB2A与胃癌细胞周期无关，但miR-3620-3p可促进胃癌细胞凋亡。

目录

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摘要

英文缩略语

论文一 胃癌中miR-3620-3p的异常表达及下游lncRNAs的确定

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 MiR-3620-3p靶向调控lncRNA-TUBB2A抑制胃癌细胞增殖、侵袭

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 长链非编码RNA在肿瘤发生、发展中的研究现状

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