干扰素α对大鼠恐惧条件反射行为的影响及相关机制的研究

摘要

大量数据表明，创伤后应激障碍(PTSD)患者在经历重大物理或心理创伤后体内一些固有免疫细胞因子水平增加，而且这些细胞因子水平和PTSD症状的严重程度呈正相关。但是目前尚不明确固有免疫细胞因子水平异常与精神障碍之间有无必然的因果联系。
　　PTSD患者的一个最重要的精神病理学特征是：对创伤发生时的记忆长久且深刻，反映出其对条件刺激(CS)诱发的恐惧消退能力减弱。在神经生物学研究中，常用恐惧条件反射模型来探讨学习和记忆的脑神经机制。恐惧条件反射是一种经典的巴甫洛夫学习反射：同时给予实验动物非伤害性的条件刺激（光或声音）和伤害性的非条件刺激(UCS)（足底电击）多次后，则实验动物对条件刺激产生恐惧反应（僵直）。在这种恐惧条件反射建立之后，再单独给予实验动物条件刺激而不伴有非条件刺激，如此重复多次，则实验动物的恐惧行为逐渐消退。
　　干扰素α(IFN-α)是一种固有免疫细胞因子，临床上常用于治疗传染性疾病和某些癌症。但是在接受IFN-α治疗的患者中往往出现抑郁等严重的精神心理障碍。动物实验研究也发现：直接向啮齿动物的脑室注射IFN-α可以引起抑郁。但是目前还没有研究报道IFN-α在恐惧条件反射行为中有何作用。神经生理学研究已经证实大脑基底外侧杏仁核(BLA)是调节恐惧条件反射消退功能的关键结构。因此我们在本研究中将IFN-α直接注射到大鼠脑BLA内，通过行为学检测的方法探讨大鼠听觉恐惧条件反射的消退过程。由于神经胶质细胞在神经系统炎症反应过程中发挥重要作用，所以我们应用免疫组化和酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法检验了给予IFN-α后大脑杏仁核中小胶质细胞和星形胶质细胞的形态和功能有何改变。此外，我们还进一步探讨了预先给予实验大鼠米诺环素(Minocycline)能否抑制胶质细胞的激活，减少白细胞介素-1（IL-1）等细胞因子的分泌，从而缓解IFN-α诱导的恐惧消退行为障碍。
　　目的：
　　1)探讨杏仁核内注射IFN-α对大鼠听觉恐惧条件反射消退过程的影响。
　　2)观察IFN-α对杏仁核内小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元细胞形态和功能的影响。
　　3)检验通过给予米诺环素抑制胶质细胞激活能否缓解IFN-α诱发的神经功能障碍。
　　方法：
　　1、杏仁核埋管和药物微量注射
　　向大鼠腹腔注射水合氯醛诱导全麻状态，将其固定在脑立体定位仪上手术。做头顶部正中切口，暴露前囟点。根据立体定位图谱标定的坐标，将两个22号不锈钢管套管分别植入两侧杏仁核，并以牙科水泥速凝固定，为防止堵塞用28号套管芯插入每一套管。手术后前三天给大鼠注射抗生素，给予大鼠5天的恢复时间并监测其状态。
　　在上午10点-12点进行IFN-α微量注射给药，大鼠微量麻醉并固定后，打开套管封闭处，连接微量注射器及微量注射泵，以0.1μl/min的速度缓慢注入药品，注射时间10分钟，然后继续留置注射器2分钟后拔出，以便药物充分吸收。
　　2、恐惧条件反射和药物治疗
　　用大鼠恐惧条件反射实验来模拟PTSD行为。大鼠在植入微量注药管手术后恢复5天。在恐惧条件反射实验前一天，大鼠置于实验箱环境习惯30分钟。次日大鼠先接受5个声音条件刺激，接下来接受恐惧条件反射刺激，包括7个声音刺激+足底电击。待实验动物建立起稳定的对条件声音刺激的恐惧反应（僵直）之后，经预先埋植在大脑杏仁核内的微量注射管给药。然后将大鼠放回饲养笼休息，8小时后，再次将大鼠放置实验箱内接收仅15次单独的声音刺激而不伴有电击刺激，观测大鼠对声音刺激恐惧反应的消退情况。
　　为了评估米诺环素的影响，大鼠在接受恐惧条件反射实验前三天分别接受米诺环素或者生理盐水灌胃。另外设置一组只接受米诺环素灌胃而不接受大脑杏仁核内给药(IFN-α)的大鼠作为对照，以评估米诺环素对恐惧消退行为的影响。
　　3、免疫组化
　　行为学测试结束后，在大鼠全麻条件下用多聚甲醛灌流固定，断头取脑，用4％的冷多聚甲醛浸泡24h后进行石蜡包埋，切取杏仁核区脑组织，在前囟后2.0mm-3.0mm部位做5μm厚度的连续切片。每隔10个切片取出三张做Iba1、GFAP及NeuN染色，余下切片随机选取针孔完整清晰的几张做HE染色。抗体孵育和染色方法步骤严格按照试剂说明书进行，染色结束后立即用显微镜观察，并拍照采集染色结果。
　　4、细胞计数
　　在40倍光学显微镜下采集免疫组化和HE染色后的图像，并采用图像处理软件对免疫组化图片进行计数分析，记录每张切片上免疫阳性细胞数，记录每只鼠左右侧脑切片内细胞计数的平均值，进行统计学分析。
　　5、炎症因子测定
　　用酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法检验IL-1β和TNF-α的水平。大鼠全麻状态下断头取脑，剥离新鲜的杏仁核组织加入1ml0.01M PBS，快速低温匀浆超声。4℃，12，000rpm离心15分钟。收集上清液储存到-80℃，直至使用前被取出融化。按照试剂盒的提示操作说明测量，并且对每个样品进行蛋白定量，结果以pg/mg蛋白的形式给出。
　　6、统计学方法
　　实验数据采用SPSS软件进行统计分析，数值均以，_土SE的方式来表示。Kolmogorov-Smirnov检验用于检测数据是否服从正态分布，双因素重复测量方差分析用来检验大鼠在不同分组和不同试验点的僵直时间。ANOVA和Tukey's post-hoc检验用于分析细胞数目和ELISA结果。以p＜0.05作为具有统计学差异的标准。
　　结果：
　　1、杏仁核内注射IFN-α可以引起大鼠听觉恐惧条件反射消退障碍
　　当大鼠建立起对条件刺激（声音）的恐惧反应之后，再进行恐惧条件反射消退实验（给予单独的声音刺激而不伴有电击刺激），结果发现对照组大鼠的恐惧反应（僵直时间）逐渐减少(F14，420=74.2，p＜0.001)，而接受IFN-α注射组大鼠恐惧消退速度显著降低(F3，420=66.4，p＜0.001)，并且实验组和刺激重复次数两个因素之间存在着显著的交互作用(F42,420=6.2，p＜0.001)。大鼠的恐惧消退的障碍程度与其接受的IFN-α注入的剂量之间存在正相关关系。
　　2、IFN-α注射后杏仁核内小胶质细胞和星形胶质细胞的激活IFN-α注射可诱导大鼠杏仁核小胶质细胞和星形胶质细胞激活。激活的胶质细胞体积变大，变粗变厚甚至出现吞噬的形状，而且Iba1和GFAP染色阳性细胞数量也明显增加(p＜0.01)。IFN-α注射并没有导致杏仁核内神经元产生明显形态改变和NeuN染色阳性细胞数量的变化。
　　3、预先给予米诺环素可以部分缓解IFN-α诱发的恐惧消退功能障碍
　　在恐惧消退实验中，我们发现给予米诺环素+IFN-α组大鼠比给予生理盐水+IFN-α组大鼠的恐惧行为消退较快(F2,405=36.3，p＜0.001)，但是仍然比正常对照组大鼠的恐惧消退过程慢(F28,405=6.9，p＜0.001)。单独给予米诺环素对大鼠的恐惧消退行为没有明显影响。
　　4、米诺环素抑制IFN-α诱导的小胶质细胞的激活，但是不能抑制星形胶质细胞的激活
　　免疫组化检测发现给予米诺环素+IFN-α组大鼠杏仁核内Iba1染色阳性小胶质细胞数量比生理盐水+IFN-α组明显减少(p＜0.01)，说明米诺环素可以抑制IFN-α诱导的小胶质细胞激活。但是米诺环素+IFN-α组GFAP染色阳性的星形胶质细胞数量与生理盐水+IFN-α组相比没有明显变化(p＞0.05)，因此米诺环素对星形胶质细胞的激活没有明显影响。
　　5、米诺环素抑制了IFN-α引起的IL-1β和TNF-α的产生
　　ELISA检测的结果显示：与对照组相比，单独给予IFN-α组和给予生理盐水+IFN-α组大鼠杏仁核内IL-1β和TNF-α浓度都显著增加(p＜0.05)，而米诺环素+IFN-α组却没有明显变化(p＞0.05)。说明米诺环素能明显降低IL-1β和TNF-α的水平。
　　结论：
　　我们首次证实了IFN-α可以作用于大脑杏仁核引起大鼠的恐惧记忆消退障碍。IFN-α可能引起杏仁核内胶质细胞激活，促使其分泌大量的IL-1β和TNF-α等炎症细胞因子，从而导致了控制恐惧消退行为的神经元功能异常。给予米诺环素抑制小胶质细胞的激活能减轻IFN-α诱发的恐惧消退功能障碍，减少IL-1β和TNF-α的分泌。但是米诺环素对星形胶质细胞的激活状态没有明显影响。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 干扰素α对大鼠听觉条件反射行为的影响及相关的神经病理机制

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 米诺环素对干扰素α诱导的恐惧消退障碍的保护作用及相关机制

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 干扰素对中枢神经系统活动的影响

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