东北5家医院碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌耐药机制及临床感染特点研究

摘要

目的：
　　随着抗菌药物广泛而不规范的应用，细菌耐药的情况越来越严峻，世界范围内碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)开始出现广泛蔓延的趋势。近5年来全国范围，尤其是江浙地区，CRE菌株的检出率快速增长至10％以上，而东北地区CRE菌株检出率一直偏低(0～3％)，但是近两年CRE菌株分离率迅猛上升。
　　由于抗菌药物使用受到药物供应、用药习惯以及用药水平的影响，细菌耐药的特征往往具有地域差异，而国内对于CRE耐药菌株的研究主要集中于江浙地区，东北区域的相关报道较少。因此需要全面分析本地区CRE菌株的耐药特点，在此基础上探索“老药新用”——磷霉素联合其他药物对CRE的抗菌活性，为临床优化抗菌药物选择，进行CRE感染精准治疗提供科学数据。
　　本地区CRE耐药菌从无到有，并呈快速上升趋势，有必要深入研究本地区CRE菌株的耐药机制和分子流行病学特征，探寻耐药菌的流行病学规律，为感控部门采取有效措施防治本地CRE耐药菌的播散流行提供参考依据，进而为防控耐药菌在世界范围内蔓延提供有益的线索。
　　方法：
　　1、本研究收集2013年1月至2015年6月期间东北地区5家医院（中国医科大学附属第一医院、中国医科大学附属盛京医院、辽宁省人民医院、大连市医科大学附属第一医院、哈尔滨医科大学附属第一医院）临床分离的85株CRE菌株，进行菌株鉴定，采用微量肉汤稀释法测定13种抗菌药物对受试菌株的药物敏感性。同时通过体外药敏试验研究磷霉素与其他抗生素联合对CRE体外抗菌活性。
　　2、分别通过改良Hodge试验、EDTA协同试验进行碳青霉烯酶的表型检测，应用PCR基因扩增技术及DNA测序方法对受试菌株进行碳青霉烯酶基因型的检测，同时以PCR检测结果为金标准比较其他两种碳青霉烯酶检测方法。
　　3、通过对受试菌株中肺炎克雷伯杆菌进行多位点序列分型(multilocussequence typing，MLST)，探讨其克隆相关性和分子流行病学特征。同时分析不同ST分型下碳青霉烯耐药肺炎克雷伯杆菌的耐药表型、耐药机制及菌株感染的临床特点。
　　结果：
　　1、本研究共收集到碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌85株，以肺炎克雷伯杆菌为主(61/85，71.8％)，药敏结果显示对大多数临床常用抗菌药物均耐药，耐药率最低的是多粘菌素(21.2％)和替加环素(20.5％)。以磷霉素为基础的体外联合药敏试验提示磷霉素与美罗培南、替加环素联合以协同相加作用为主，磷霉素联合阿米卡星或多粘菌素以无关和相反作用为主。
　　2、85株CRE中改良Hodge试验和EDTA协同试验阳性菌株分别为49株、12株。经PCR检测共检出64株产碳青霉烯酶基因分别为KPC-2(53/85，62.4％)、IMP-4(10/85,11.8％)、NDM-5(7/85,8.2％)、NDM-6(1/85,1.2％)。以PCR为金标准，改良Hodge试验对85株CRE菌株中碳青霉烯酶检出灵敏度和特异性分别为83.0％(44/53)、84.4％(27/32)，EDTA协同试验对18株产金属酶菌株的灵敏度和特异性分别为55.6％(10/18)、97.0％(65/67)。
　　同时采用了PCR和DNA测序分析对85株CRE菌株进行了超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrumβ-Lactamases，ESBLs）基因检测，产CTX-M-1组ESBLs的菌株有37株，产CTX-M-9组ESBLs的菌株有21株，未检测出TEM型及SHV型酶。结合碳青霉烯酶基因的检测结果显示，共有35株产碳青霉烯酶的CRE菌株同时携带超广谱β-内酰胺酶，其中KPC酶合并CTX-M-1组ESBLs菌株数最多（14株），其次为IMP酶合并CTX-M-9组ESBLs（5株）。
　　3、MLST分型显示61株碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae-Klebsiella pneumoniae，CRE-KPN)共有18种ST分型，ST11为优势型别(53.3％)，研究同时发现这部分ST11型菌株更容易对碳青霉烯类抗生素耐药且MIC值较高，大部分携带KPC-2型碳青霉烯酶。其他序列型中ST2033、ST2135、ST2193、ST2194、ST2195、ST2196为世界范围内首次注册，其中eBURST分析提示ST2193、ST2194、ST2195与ST11有很密切的亲缘性。结合临床资料发现同一家医院同一时期以相同克隆流行为主。
　　临床资料分析提示CRE-KPN感染的患者年龄偏大，大多数接受过ICU的治疗，67.4％的患者同时合并感染多种耐药菌株，菌株分离前使用最多的抗菌药物为三代头孢菌素及酶抑制剂复合制剂(88.4％)和碳青霉烯类抗菌药物(60.5％)。单因素分析提示ST11组患者在重症监护病房接受治疗所占的比例及机械通气的使用率高于非ST11组，具有统计学差异。
　　结论：
　　东北5家医院临床分离的CRE菌株以肺炎克雷伯杆菌为主，对大多数抗生素耐药，其中对于CRE指南推荐的替加环素和多粘菌素也存在20％的耐药率，临床可以选择的抗菌药物极其有限。在此基础上进行的体外联合药敏试验发现磷霉素—美罗培南、磷霉素—替加环素体外联合具有良好的抗菌活性，为探索本地区碳青霉烯类耐药肠杆菌感染临床治疗提供了积极的指导意义。
　　本地区CRE菌株以产KPC-2型碳青霉烯酶为主，接近50％的产碳青霉烯酶菌株同时携带超广谱β-内酰胺酶，其中KPC酶合并CTX-M-1组ESBLs菌株数最多，其次为IMP酶合并CTX-M-9组ESBLs，复杂的耐药机制给临床耐药菌的防控增加了难度。
　　多位点序列分型研究发现本地区碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌共有18种ST型别，以ST11为主，其中有6个新的ST型别(ST2033、ST2135、ST2193、ST2194、ST2195、ST2196)为世界范围内首次报道，同时eBURST分析发现ST2193、ST2194、ST2195与ST11有很密切的亲缘性。新型ST的发现提示CRE-KPN存在克隆性和多样性，应给予密切关注和监测。结合临床资料发现同一家医院同一时期以相同克隆流行为主，提示CRE-KPN菌株有局部播散的风险。鉴于临床资料分析提示接受过ICU治疗和机械通气的患者容易发生CRE-KPN菌株（特别是ST11型）感染的风险，而且ST11型菌株非常容易获得编码KPC-2基因的质粒，造成对碳青霉烯类抗生素的高度耐药，并且大规模地流行，临床对于此类高危人群应密切监测CRE菌株流行状况，以便采取有利措施防控CRE菌的暴发流行。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

论文一 碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的药物敏感性分析及磷霉素与其他抗生素联用对耐药菌株体外抗菌活性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文二 碳青霉烯类耐药肠杆菌碳青霉烯酶及超广谱β-内酰胺酶的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

论文三 碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌MLST分析及不同ST分型菌株耐药机制和感染患者临床特点的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 耐碳青霉烯类抗生素肠杆菌科细菌的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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