Lamin B2与MCM7相互作用调节非小细胞肺癌增殖

摘要

目的:核纤层蛋白位于细胞核内层核膜下，通过绑定各种细胞核蛋白进而参与细胞核及核骨架的组装、维持核骨架及基因组的稳定、调控染色质及基因的表达、调节细胞分化等诸多细胞内活动。Lamins蛋白可分为A型、B型和C型，而B型又分为B1和B2两种亚型。Lamins A和C是由同一个基因通过选择性剪切而获得的。Lamins B1和B2分别由LMNB1和LMNB2编码，在细胞发育和分化过程中表达。近年来关于Lamins与肿瘤间关系的研究越来越多，如:Lamin A/C高表达与结肠癌预后较差和干细胞样特征相关，而在Ⅱ期、Ⅲ期结肠癌中Lamin A/C低表达与复发风险增加有关。Lamin A/C高表达还与神经母细胞瘤、前列腺癌、肝细胞癌、乳腺癌、低级别子宫内膜癌的预后差有关。Lamin A/C在肺腺癌细胞中比率及分布异常。而关于Lamin B的研究仅见Lamin B1在肝细胞癌、前列腺癌、胰腺癌其表达升高预示预后差。关于Lamin B2与肿瘤细胞增殖的关系仅有两份报道:其一是Lamin B2在卵巢癌中高表达，另一例是Lamin B2在前列腺癌中低表达。
　　微小染色体维持蛋白(Minichromosomal maintenance，MCM)家族有MCM2-7六个蛋白成员，这六种蛋白在DNA复制前期（G1早期），形成一个环形异六聚体复合物，并与Cdc6、Cdt1相互作用，在Cdc45引导下，绑定到DNA双链的复制起始点，MCM4/6/7作为复合物的催化核心，发挥解旋酶作用，而MCM2或MCM3/5则发挥调控MCM复合物活性的功能，当DNA复制完成后与其分离，以确保DNA复制期的正常进行以及每个复制周期DNA只复制一次。近年来的研究表明，MCM7在非小细胞肺癌、肝癌、卵巢癌、前列腺癌及神经母细胞瘤中均为高表达且与不良预后相关。
　　RB是染色质结合蛋白，通过管理转录因子E2F，来限制细胞周期基因的转录及细胞增殖基因的表达。RB的活性受细胞周期蛋白依赖激酶的调控，在G1/S交界期，RB被CDK磷酸化而失活，释放E2F促进细胞进程。研究表明，RB蛋白的持续失活会导致肿瘤的发生。
　　综上所述，以上三种蛋白的表达改变均与肿瘤的发生相关，而本研究的主要目的是:通过实验明确Lamin B2在非小细胞肺癌增殖方面所起的作用及与MCM7和RB之间的关系。具体如下:1.证实LaminB2在肺癌组织中高表达。2.证实LaminB2可促进非小细胞肺癌增殖。3.证实Lamin B2与MCM7直接结合，增强MCM7解旋酶的活性、提高与染色质结合的能力，进而影响非小细胞肺癌的增殖、肿瘤形成及DNA的复制。4.证实Lamin B2与RB在MCM7的C端存在竞争性结合的关系。5.证实Lamin B2与MCM7在肺癌组织中高表达与临床病理因素及不良预后相关相关。
　　研究方法:1.组织来源、组织芯片及免疫组化:本研究中Western blot和qPCR用到的组织，均在中国医科大学伦理委员会监督下进行。在中国医科大学附属第一医院搜集2008-2015年20例对应的癌及癌旁正常肺组织(距肿物边界大于5cm)标本，所有标本来源的患者均接受肺癌手术但没有接受过术前放化疗治疗，而且具有完整的随访资料，随访从手术之日起到随访结束日期或由于复发、转移而死亡之日止。根据WHO-2015肺癌组织学分类标准和2010年国际抗癌联盟TNM分期标准进行重新评估。组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司且有完整详细的芯片资料。芯片经二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水，抗原修复步骤后，采用S-P试剂盒进行组化反应(KIT-9710，Ultrasensitive TM S-P, MaiXin，China)，利用Lamin B2(1∶100;Abcam)抗体进行一抗孵育4℃过夜。生物素标记的二抗(Ultrasensitive; MaiXin，Fuzhou，China)37℃孵育30分钟，DAB显色。在每块芯片的组织点上，随机选5个视野，每个视野都进行计数约500个细胞。然后依据所计数的细胞着色的百分比，将表达Lamin B2的细胞数目进行划分，五个等级分别为:0分（无细胞着色），1分(1-25％的细胞着色)，2分(26-50％的细胞着色)，3分（51-75％的细胞着色），4分(76％以上的细胞着色)。依据细胞着色的强度，我们将Lamin B2的表达划分成2个等级:1分（浅黄色颗粒），2分（深黄色颗粒）。每张切片的最终得分为:切片细胞数目等级评分与着色分数等级评分的乘积。将得分小于或等于4判为低表达，而将得分大于4判为高表达。
　　2.细胞培养与试剂:人肺腺癌细胞系A549和H1299均购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。细胞培养于37度、5％二氧化碳的细胞培养箱内。培养基为RPMI-1640及10％胎牛血清(Gibco，Life Technologies)和1％的青霉素-链霉素(JRH Biosciences,St.Louis,MD,USA)。质粒pCMV6-LMNB2-GFP(5'-GGACTTTCCAAAATGTCG-3';5'-ATTAGGACAAGGCTGGTGGG-3')和对照组GFP-vector均购自于OriGene Technologies(Beijing，China)。质粒pENTER-MCM7-Flag(5'-GATCGCCATGGGGCACTGAAGGACTACGCGC-3',5'-TTGGCGCGCCAACCGGGGTGTGACAAAA TGATCC-3'）及突变体质粒pENTER-△MCM7-VS(5'-GATCGCCATGGGTAAGCCTATCCCTAACCCTCTCCCGGTCTCGATTCTACGGCACTGA AGGACTAC-3',5'-TTGGCGCGCCAACCGGGGTGTGACAAAATGATCC-3'）均购自于上海泰和生物技术有限公司。干扰质粒LMNB2(LMNB2-RNAi)(5'-TGGAGATCAACGCCTACCG-3'，5'-AGCCGCTTCCG CTTAC TG-3')及对照组质粒(NC-RNAi)均购自于上海吉凯生物技术有限公司。
　　3.蛋白电泳:采用RIPA裂解液提取肺癌组织或培养细胞中的蛋白(Millipore，Billerica，MA，USA)，用分光光度记，以胎牛血清作为标准进行蛋白定量，计算各样品蛋白浓度。将含80μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳1.5h后，用PVDF膜转印(220mA，1.5h)，5％脱脂奶粉室温封闭1.5h，用TTBS(20mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，0.05％ Tween-20)冲洗3次/5分钟，单克隆抗体Lamin B2(1∶1000，Abcam，美国)4℃放置过夜后，辣根过氧化物酶标记的二抗37℃放置1.5h，TTBS洗3次/5分钟，ECL发光液显色。以GAPDH为内对照，用凝胶成像分析系统(Biolmaging Systems)检测条带灰度值，并取其与GAPDH的比值做为相对表达量。
　　4.RNA提取及qPCR:使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen，Hilden，Germany)从细胞中提取总RNA。根据PrirneScriptTM RT Master Mix(TaKaRa，China)实验说明书，1微克RNA用于逆转录实验。qPCR采用使用总量为20微升体系的SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, CA)在ABI7900 PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)中完成。运行qPCR反应板热循环反应为50℃2min，95℃10min，95℃40s，40个循环，然后60℃60s。GAPDH作为内参，基因表达的倍数改变采用2-ΔΔCt方法计算，实验重复3次。
　　5.克隆形成:A549和H1299细胞转染24小时后接种到40mm培养皿（每孔1000个细胞）生长12天，每4天换一次含10％胎牛血清的培养基一次。用苏木素染色并计数大于50个细胞的集落。
　　6.MTT实验:消化并收集对数生长期细胞，进行细胞计数，调整细胞悬液浓度至1.0×104个/ml后，接种于96孔板，细胞数为1.0×103个/孔，次日细胞贴壁并进行干扰质粒转染，于37℃，5％ CO2培养箱中分别培养至12h、24h、48h、72h后，每孔加入5 mg/ml MTT20μl，置培养箱中孵育4h后吸去各孔中培养液，加入200μlDMSO以溶解细胞形成的结晶，在酶标仪上测定其在490 nm处OD值，每种细胞每个浓度检测8孔，以其平均值为该时段光吸收值，进行数据分析。
　　7.流式细胞术检测细胞周期:消化并收集转染后培养48h的细胞制成1×107/ml细胞悬液，取1ml细胞悬液加入预冷75％乙醇，4℃固定2h后，离心收集细胞，弃去上清液，每管细胞样品中加入500μl染色缓冲液重悬。加入25μl碘化丙啶(PI)染色液(Sigma，美国)混匀后，加入10μl RNase A混匀，37℃避光温育30 min后冰浴避光存放，随即进行流式细胞术检测，ModFit LT3.0软件分析细胞周期。
　　8.免疫荧光实验:细胞经4％多聚甲醛固定，0.2％TritonⅩ-100打孔5分钟，用5％BSA室温封闭1小时后，加入一抗，4℃孵育过夜，次日加入山羊抗兔/鼠二抗、罗丹明二抗避光孵育。细胞核采用DAPI染色，甘油封片，采用Radiance2000荧光共聚焦显微镜(Carl Zeiss，Thomwood，NY, USA)采集图片。每一步染色之后均用PBS洗3三次/5分钟。
　　9.免疫共沉淀:将收集到的细胞用预冷的PBS洗涤后，用NP-40及1％PMSF裂解。4℃环境下15000g离心25分钟，每毫克蛋白裂解液加5ug抗体4℃摇床过夜，加50％Immunomagnetic Beads Protein G磁珠(sinobiological，Beijing)50ul，4℃摇床4小时后收集磁珠做蛋白电泳分析。
　　10.酵母双杂交:本实验酵母双杂交系统的pGADT7-AD克隆载体、pGBKT7-BD克隆载体（诱饵表达质粒）、BD阳性对照质粒pGBKT7-T、BD阴性对照质粒pGBKT7-1am、酵母双杂交系统MATCHMAKER Gal4、酵母菌株AH109、酵母菌培养液YPDA、人工合成营养缺陷型培养液（SD-Trp、SD-Leu、SD-Trp/Leu/His和SDTrp/Leu/His/Ade）和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside，X-gal）均购自Clontech公司。酵母双杂交检测:诱饵表达质粒pGBKT7-MCM7的构建及鉴定:构建MCM7全长的引物(5'CAGCCAAGCTCAACATATGGCACTGAAGGACTACGCG3',5'TTCATTTCAAGCAAAGTCGACGGAGTAAGTGCAGCATGGGAG3')后，利用PCR法在目的片段的两端引入限制性内切酶Nde1和Eco R1，随后采用双酶切位点定向亚克隆至载体pGBKT7中，转化大肠埃希菌Top10C，氨苄青霉素筛选阳性克隆，扩增培养后提取质粒DNA，再用Nde1和Eco R1双酶切处理提取的质粒，鉴定插入片段大小，即为构建获得的诱饵质粒pGBKT7-MCM7，测序后，与GenBank MCM7基因序列比较同源性。按照MATCHMAKER GAL4操作手册，采用醋酸锂法将诱饵表达质粒pGBKT7-MCM7与前期工作中筛选获得的、经测序鉴定证实的质粒pGADT7-Lamin B2(建于如前所述)，共同转化至酵母菌株AH109中，随即涂布于含SD-Trp/Leu/His/Ade-X-gal的平板上，30℃条件下培养至菌落生成，并重复传代3次。
　　11.GST融合蛋白及GST-pulldown:构建pGST-MCM7突变体:pGST-MCM7N，pGST-MCM7 M，pGST-MCM7 C。将含有各突变体蛋白及GST蛋白的大肠杆菌在100ml的Luria-Bertani培养基及氨苄西林(60 ug/ml)中37℃过夜，后加IPTG诱导30℃、3小时，冰上1％ Triton X-100裂解超声，收集蛋白15，000g、15分钟，取上清加GST磁珠摇床3小时，离心15，000g、15分钟取沉淀为后续蛋白电泳做准备。
　　12.染色质关联分析:细胞裂解液悬浮于试剂A(110 mM KC2H3O2，15mMNaC2H3O2,2 mM MgC2H3O2,0.5 mM EGTA,20 mM HEPES pH7.3)，并加入2mMDTT和50μg/ml洋地黄皂苷，4℃、10分钟后，1500g离心10分钟后，悬浮于高渗溶液B中1mM HEPES pH7.5，0.5 mM EDTA supplemented with0.5％ NP-40)孵育15分钟后倒入10ml蔗糖垫溶液中(100 mM蔗糖，0.5 mM Tris-HCl，pH8.5)，离心3500g、15分钟。染色质沉淀悬浮于0.25 mM EDTApH8.0中超声3次×10秒，高速离心两次，每次10分钟，将所得沉淀进行蛋白电泳实验。
　　13.解旋酶活性实验:细胞裂解液与MCM7抗体共同孵育2小时后，加入如前所述的免疫共沉淀磁珠进行分离，将分离后的沉淀与pUC19模版共同孵育(5'-CAAGTTGGGAAGACAACCTG-3'/5'-Cy5-CCAATATGGTGAAACCCCGT-3')于20 mmol/L Tris-HCl, pH7.4,50 mmol/L NaCl,3mmol/L MgCl2,2mmol/L ATP,20％甘油，0.1％胎牛血清溶液中，加入探针(5'-CAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGT-3')室温孵育30分钟后，170 mmol/L EDTA，pH8.0溶液终止反应。用streptavidin-agarose磁珠进行捕获后Tris-Tween-20溶液洗三次，用Thermovarioskan flash测荧光值并做统计分析。
　　14.裸鼠成瘤实验:20只BALB/c裸小鼠，5周龄，雌性（从上海史莱克公司购买）饲养于恒温，恒湿的半屏障系统中饲养。按照中国医科大学动物实验伦理条例实施动物实验。将转染了LMNB2-RNAi及NC-RNAi质粒的H1299细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液用细胞计数板对细胞进行计数，并最终用一定体积的D-Hanks重悬，使细胞悬液的浓度为3×106个细胞/ml，然后用一次性注射器，吸取1mL，皮下注射至动物右前肢腋下。每只200ul。25天后，每两天观察一次成瘤情况并测量肿瘤大小，动物体重。测量两周后在处死动物前对动物进行活体成像，成像仪(BERTHOLD TECHOLOGIES，LB983):按10ul/g的量，腹腔注射0.7％戊巴比妥钠麻醉动物，数分钟后待动物麻醉，将其放置于活体成像仪下进行成像，观察荧光，保存数据。然后实验动物进行颈椎处死。在白板上排列好动物，并将把标尺分别放在左侧与上方，用来观察具体刻度，用照相机拍下动物照片。然后用医用剪刀和医用镊子小心取出肿瘤，在白板上整齐排列好后拍照保存。同样需要标尺作为参照，读取刻度，并将取出的肿瘤称重。整理数据，分析结果。
　　15.统计分析:所有的数据采用SPSS22.0版本进行统计学分析。采用Chi.Square检验Lamin B2表达与临床病理因素之间的关联。采用t检验检测Western Blot结果中的灰度值、集落形成实验结果计数等。P＜0.05作为有统计学意义。
　　结果:1.Lamin B2在肺癌组织中高表达。与癌旁组织相比，在癌组织中LaminB2的基因，蛋白及mRNA水平均高表达(P＜0.01）。2.Lamin B2促进肺癌细胞的增殖。干扰Lamin B2抑制肺癌细胞的增殖(P＜0.01）并促进凋亡(P＜0.01)，抑制细胞进入S期;而转染Lamin B2促进肺癌细胞增殖(P＜0.01），抑制凋亡(P＜0.01)，促进细胞进入S期。裸鼠体内成瘤实验证实，Lamin B2促进非小细胞肺癌的肿瘤形成(P＜0.01）。3.Lamin B2与MCM7的C端直接结合，增强MCM7的功能，促进肺癌细胞的增殖。酵母双杂交、免疫荧光及免疫共沉淀的实验结果均表明，Lamin B2与MCM7可在体内、外直接结合，且共定位于细胞核，同时Lamin B2不能与MCM其他家族成员结合，而MCM7亦不与Lamin家族的其他成员相结合。进一步应用GST pull-down实验，我们发现二者结合域位于MCM7的C端。构建MCM7 C端缺失突变体，将共转染全长MCM7及Lamin B2作为对照组，共转染缺失突变体及Lamin B2作为实验组，结果显示，对照组细胞增殖的能力不如实验组细胞增殖能力强，即当Lamin B2与MCM7的C端结合才能发挥促进肺癌细胞增殖的作用(P＜0.01)。同时，当二者结合后，LaminB2可促进MCM7的功能:即干扰LaminB2的表达可减弱MCM7解旋酶的活性(P＜0.01），降低MCM7与染色质结合的能力，转染LaminB2后MCM解旋酶活性及其与染色质结合的能力均增强(P＜0.01)。4.LaminB2与RB竞争性结合MCM7C端。免疫荧光及免疫共沉淀的实验均证实，RB可与MCM7C端直接结合。应用ELISA及滴度共沉实验证实Lamin B2与RB存在竞争性结合的关系(P＜0.01）。转染Lamin B2后，由于Lamin B2与RB竞争导致RB与MCM7的结合减少（P＜0.01），相应磷酸化的RB增多(P＜0.01），释放更多的E2F(P＜0.01)，促进细胞的增殖及细胞周期，而干扰LaminB2后以上现象均相反。(P＜0.01)。5.Lamin B2与MCM7在肺癌组织中高表达与临床病理因素及不良预后相关相关。我们分别对Lamin B2及MCM7的150例组织芯片进行统计学分析，结果证实Lamin B2与MCM7在肺癌组织中高表达与临床病理因素中肿瘤的分化程度(P＜0.05)及TNM分期(P＜0.05)相关且与不良预后亦相关(P＜0.05)。
　　结论:1.Lamin B2在肺癌组织中高表达。2.Lamin B2促进非小细胞肺癌的增殖。3.Lamin B2与MCM7C端直接结合，增强MCM7解旋酶活性及与染色质结合的能力，进而促进肺癌细胞增殖。4.Lamin B2与RB竞争性结合MCM7C端。5.Lamin B2与MCM7在肺癌组织中高表达与临床病理因素及不良预后相关相关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2 材料与方法

2．1 组织来源、组织芯片及免疫组化

2．2 细胞培养与试剂

2．3 蛋白电泳

2．4 RNA提取及qPCR

2．5 克隆形成

2．6 MTT实验

2．7 流式细胞术检测细胞周期

2．8 免疫荧光实验

2．9 免疫共沉淀

2．10 酵母双杂交

2．11 GST融合蛋白及GST pulldown

2．12 染色质关联分析

2．13 解旋酶活性实验

2．14 裸鼠成瘤实验

2．15 统计分析

3 结果

3．1 Lamin B2在肺癌组织中高表达

3．2 Lamin B2促进肺癌细胞的增殖

3．3 Lamin B2与MCM7 C端直接结合，增强MCM7功能，促进肺癌细胞增殖

3．4 Lamin B2与RB竞争性结合MCM7 C端

3．5 Lamin B2与MCM7在肺癌组织中高表达与临床病理因素及不良预后正相关

4 讨论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 核纤层蛋白调控染色质动态变化的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历