PRDX5-Nrf2相互作用对氧化应激条件下的非小细胞肺癌肿瘤细胞增殖、凋亡及耐药的研究

摘要

肺癌是一种十分常见的恶性肿瘤，其死亡率位居全球恶性肿瘤的第一位[1]，而非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)又占到所有肺癌病例的80％以上，并且具有存活期短、复发率高且耐药现象普遍的特征。近几年对非小细胞肺癌的发病、发展与治疗预后的机制研究成了一大热点，其中活性氧(reactive oxidative species，ROS)由于对肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移及耐药有着重要作用，所以成为了一个热门的研究领域。近期的文献报道中有信息表明Nrf2与PRDX5同属抗氧化蛋白，并且对于肿瘤细胞的增殖凋亡与耐药有一定的调控作用，同时在课题组前期研究已经证明Nrf2与PRDX5有协同作用的基础上，进一步探究PRDX5-Nrf2对氧化应激条件下NSCLC的增殖凋亡及耐药的影响。实验方法:在非小细胞肺癌细胞中过表达PRDX5或干扰PRDX5表达，用100μMH2O2刺激细胞，分别刺激(0min、10min、30min、1h、3h、6h)后，收集蛋白样及RNA，分别用Western blot和RT-QPCR检测PCNA、NQO1、KI67及CleavedCaspase3的表达变化;又通过干扰PRDX5的表达，(0、25、50、100、200)μM H2O2刺激细胞，收集蛋白，用Western Blot检测PARP、NQO1及CleavedCaspase3的表达变化。由实验结果可知:随着H2O2作用细胞的时间或强度增长，胞内PRDX5的表达增加，并且能激活Nrf2下游的的抗氧化靶基因NQO1的表达，促进增殖相关分子PCNA与KI67的合成，从而抑制细胞的的凋亡相关基因Cleaved Caspase3的表达，PARP的表达则呈现先上调后下调的趋势;而过表达PRDX5后NQO1，PCNA与KI67的表达量与对照组相比上调的趋势更加明显，Cleaved Caspase3则变化不显著;另外在PRDX5的表达被干扰后，会相应下调NQO1，PCNA及KI67的表达，上调Cleaved Caspase3的表达，但随着H2O2作用细胞的时间或强度增长，NQO1与PARP表达量上调，PCNA与KI67下调，Cleaved Caspase3表现整体下调的趋势。
　　另外在非小细胞肺癌细胞中分别过表达PRDX5、干扰PRDX5表达及干扰Nrf2表达的三组细胞株中用顺铂(0、12.5、25、50、100、200)μg/mL刺激24h，用MTT检测细胞的存活率，并且在过表达PRDX5的细胞中干扰Nrf2的表达，用(0、25、50、100、200)μM H2O2刺激细胞，收集蛋白用Western Blot检测MRP1的表达变化。由实验结果可知:PRDX5过表达组的耐顺铂能力明显高于CK组，而PRDX5与Nrf2被干扰表达后，细胞对于顺铂的耐药性较于CK组有明显降低的状态。再根据氧化应激下过表达PRDX5组细胞中MRP1的表达变化可知，随着氧化应激强度的增大，细胞中多药耐药蛋白1（MRP1）的表达量会随之上调，在PRDX5的表达增强后，MRP1的表达量随之增加，即表现为耐顺铂药物的能力增加，而在Nrf2被干扰后，即使增加PRDX5的表达量，PRDX5与Nrf2的协同作用降低，表现为MRP1的表达量明显降低，耐顺铂的能力大大降低。由此我们能得出结论，PRDX5与Nrf2的相互作用在氧化应激的条件下能提高非小细胞肺癌细胞的增殖活力，抑制凋亡行为并且能提高细胞的耐药能力。

目录

声明

摘要

引言

1．1主要试剂与耗材

1．2主要试剂配制

1．3主要仪器

1．4所用细胞株

1．5实验用质粒，siRNA

1．6实验所用菌株

2、实验方法

2．1细胞培养

2．2细胞转染

2．3细胞过氧化刺激

2．4 Western Blot

2．5 RT-QPCR

2．6质粒扩增

2．7 MTT法测细胞存活率

第二章结果

1、摸索干扰PRDX5表达质粒及PRDX5过表达质粒最佳转染条件

1．1小片段siRNA对A549、H1299细胞中PRDX5表达干扰的效果

1．2 pcDNA3．1-PRDX5／Flag与pHBLV-U6-shRNA-PRDX5-ZsGreen在A549、H1299细胞中的最佳转染条件

2、在氧化应激的条件下，PRDX5对非小细胞肺癌中的NQO1、K167、PCNA及Cleaved Caspase3具有调控作用

2．1在H2O2浓度一定的条件下，过表达PRDX5能上调NQO1、PCNA及K167的表达，下调Cleaved Caspase3的表达

2．2在H2O2浓度一定的条件下，干扰PRDX5的表达能下调NQO1、PCNA及K167的表达，上调Cleaved Caspase3的表达

2．3在H2O2作用时间一定时，干扰PRDX5的表达能下调NQO1与PARP表达，上调Cleaved Caspase3的表达

3、在氧化应激条件下，Nrf2与PRDX5对A549、H1299细胞中的MRP1有着明显的调控作用

3．1 H2O2能促进A549、H1299细胞中MRP1的表达

3．2过表达PRDX5能提高MRP1表达量，干扰Nrf2能下调MRP1表达量

3．3过表达PRDX5能提高A549、H1299细胞耐顺铂能力,干扰PRDX5与Nrf2的表达能降低A549、H1299细胞耐顺铂能力

第三章讨论

参考文献

附录

致谢