氧化应激条件下SOCE对EPCs细胞活性及凋亡影响的研究

摘要

背景及目的:既往研究表明，血管内皮损伤是动脉粥样硬化(AS)形成的起始因素，其修复有利于延缓AS的进展，因此，如何有效地修复受损的血管内皮便成了AS防治研究的焦点。内皮祖细胞(EPCs)具有分化为内皮细胞(ECs)，促进血管形成的能力，因此已经受到人们的广泛关注。近年来的研究发现虽然输注EPCs到动物体内可以有效延缓AS进程，但仍然存在着输注到体内的细胞生存能力低下的问题。AS进程受多种因素影响，其中大多数因素能够诱导氧化应激，而它又直接或者间接促进ECs及内皮受损，触发AS的发生且贯穿整个AS过程。另外有文献报道称氧化应激能够导致EPCs增殖、分化、迁移及粘附等能力的降低，促进细胞凋亡，因此提高EPCs在氧化应激条件下的生存能力则可能为细胞疗法治疗AS提供一种保障。
　　钙库操纵型钙内流(SOCE)是哺乳动物细胞尤其非兴奋细胞是普遍存在的一种Ca2+内流方式。SOCE由钙库操纵型Ca2+通道(SOCC)介导且在多种疾病的病理生理过程中发挥重要作用。本实验室前期研究发现EPCs上存在SOCE，改变SOCC的主要组成蛋白能够影响细胞的增殖、分化、迁移及粘附等功能。但是SOCE是否参与氧化应激诱导的EPCs损伤尚未见报道，另外越来越多的证据表明胞内Ca2+浓度和Ca2+信号通路与氧化应激密切相关。
　　因此，本研究拟利用过氧化氢(H2O2)作为氧化应激的诱导剂处理EPCs，探索SOCE在氧化应激诱导的EPCs损伤中可能发挥的作用以及相关机制，并尝试寻找减缓甚至逆转氧化应激诱导EPCs损伤的靶点及策略。
　　方法:
　　1.H2O2对EPCs细胞活性、细胞凋亡的影响
　　1.1 EPCs的分离接种、培养及鉴定
　　取雄性SD大鼠，150-180 g，腹腔注射过量的戊巴比妥钠(100μ g/kg)处死，经碘伏消毒后解剖取脾脏，接着梯度离心法分离获取单个核细胞并接种至低糖型培养基中。以培养内皮细胞的条件培养至7天，培养过程中用显微镜观察细胞贴壁情况及细胞形态变化，符合EPCs特征并用DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I荧光双吞法检测细胞是否具备EC特性。
　　1.2 H2O2对细胞活性的影响
　　EPCs培养7天，用胰蛋白酶消化后接种至96孔板，待细胞贴壁后H2O2处理，cck8检测细胞活性。
　　1.3 H2O2对细胞凋亡的影响
　　EPCs培养7天，H2O2处理细胞，凋亡相关试剂染色后上流式细胞仪检测EPCs凋亡情况。
　　2.H2O2对胞内Ca2+流、SOCE及SOCC复合体的影响
　　2.1 H2O2对胞内钙流的影响
　　2.1.1 EPCs培养7天，避光孵育Fluo-3AM，H2O2处理后观察细胞内钙流变化。
　　2.1.2 EPCs培养7天，Ca2+螯合剂(BAPTA)预处理，H2O2处理后cck-8及凋亡试剂盒分别检测细胞活性和细胞凋亡情况。
　　2.2 H2O2对SOCE的影响
　　EPCs培养7天，为了探讨H2O2诱导的胞内Ca2+浓度变化是否由SOCE引起的，避光孵育Fluo-3AM，观察无细胞外Ca2+存在情况下，H2O2和毒胡萝卜素(TG)处理，激光共聚焦显微镜下观察此时及Ca2+浓度回落后加入CaCl2溶液细胞内钙流变化。
　　2.3 H2O2对SOCC复合体的影响
　　2.3.1 EPCs培养7天，提取总RNA，半定量PCR观察SOCC复合体主要组成成分（Orai1、Stim1、Trpc1）转录水平的变化。
　　2.3.2 EPCs培养7天，提取总蛋白，BCA法测量蛋白浓度，Western blot检测翻译水平SOCC复合体主要组成蛋白（Orai1、Stim1、Trpc1）的改变。
　　2.4 抑制SOCE后观察H2O2对胞内钙浓度的影响
　　2.4.1 shRNA干扰Stim1的表达
　　EPCs培养5天，贴壁好，融合度大约30-50％，用携带shRNA的慢病毒转染2天，荧光显微镜观察并用免疫印迹法分析干扰效度。
　　2.4.2 抑制SOCE对H2O2诱导的钙内流的影响
　　药物抑制及shRNA干扰EPCs后，孵育装载Fluo-3AM，HBSS溶液洗去培养液中残留的Fluo-3AM，H2O2处理并在显微镜下观察Ca2+实时变化情况。
　　3.H2O2增强SOCE对细胞活性及凋亡的影响
　　SOCE抑制剂抑制及shStim1干扰EPCs来抑制SOCE，H2O2处理细胞后分别用cck-8和凋亡试剂盒检测细胞活性及凋亡情况。
　　4.H2O2通过SOCE引起细胞凋亡机制的探讨
　　4.1 抑制SOCE对胞内活性氧(ROS)水平的影响
　　培养EPCs，ML-9预处理或shRNA干扰抑制SOCE后加H2O2处理6小时，对比观察细胞凋亡情况。
　　4.2 抑制SOCE对caspase家族的影响
　　培养EPCs7天，H2O2处理并用免疫印迹法分析其对caspase家族蛋白的表达情况的影响，针对有明显变化的caspase家族蛋白，抑制SOCE后观察H2O2处理对蛋白表达的影响。
　　4.3 抑制SOCE对内质网应激水平及线粒体损伤水平的影响
　　观察发现H2O2处理EPCs能够显著上调caspase9和caspase12蛋白的表达水平，这说明H2O2处理可能触发了与内质网应激及线粒体功能紊乱相关的凋亡途径，为了进一步证实这一推论，用H2O2处理EPCs，免疫印迹法检测内质网应激特异性表达蛋白CHOP、BIP及线粒体功能紊乱标志蛋白cytochrome C的表达变化，并观察线粒体膜电位变化情况。以及抑制SOCE后加H2O2处理同样检测这些指标，观察其对内质网应激水平及线粒体损伤水平的影响。
　　结果:
　　1.H2O2对EPCs细胞活性、细胞凋亡的影响
　　1.1 EPCs的分离接种、培养及鉴定
　　分离获取脾源性EPCs并接种至低糖型培养基上，期间在倒置显微镜下观察发现贴壁细胞逐渐增大变变圆，最终呈现梭状、纺锤状、树突状等各种形状。荧光双吞法鉴定显示，DiI-Ac-LDL和FITC-UEA-I双阳性的细胞大概有85％，这些即为EPCs。
　　1.2 H2O2对细胞活性的影响
　　不同浓度H2O2处理EPCs6小时，cck-8检测细胞活性显示200μMH2O2时细胞活性显著降低(p＜0.05)，600μM时细胞活性接近50％。用600μM H2O2处理不同时间发现1小时后细胞活性明显降低(p＜0.05)，6小时时细胞活性降至50％左右。因此600μM H2O2处理6小时作为后续实验的实验条件。
　　1.3 H2O2对细胞凋亡的影响
　　600μMH2O2处理EPCs6小时，凋亡试剂盒检测细胞凋亡显示，细胞凋亡明显增加(p＜0.05)，而且对照组和H2O2处理组细胞凋亡率分别为5.30％和40.65％。
　　2.H2O2对胞内Ca2+流、SOCE及SOCC复合体的影响
　　2.1 H2O2对胞内钙流的影响
　　2.1.1 EPCs培养7天，避光孵育Fluo-3 AM，600μM H2O2处理并在激光共聚焦显微镜下观察，结果发现，加入H2O2后胞内Ca2+浓度迅速升高。
　　2.1.2 为了进一步探讨H2O2、Ca2+浓度与细胞活性及凋亡的关系，首先利用胞内Ca2+螯合剂(BAPTA)预处理EPCs，再用600μM H2O2处理6小时，cck-8检测发现可以显著减缓H2O2造成的EPCs活性的降低(p＜0.05)，与此同时，流式细胞仪检测结果表明H2O2造成的EPCs凋亡增加的状况也得到显著改善(p＜0.05)。
　　2.2 H2O2对SOCE的影响
　　为了探讨H2O2是否通过SOCE诱导胞内Ca2+的改变，避光孵育Fluo-3AM后，HBSS溶液洗脱细胞外Ca2+，H2O2和TG处理EPCs发现H2O2处理与TG一样能够诱导典型的钙释放激活钙内流的过程。
　　2.3 H2O2对SOCC复合体的影响
　　实验表明H2O2处理能够引起SOCE的变化，为了进一步探讨H2O2引起SOCE改变的机制，我们分别在转录水平及翻译水平检测SOCC复合体组成成分（Orai1、Stim1、Trpc1）的改变，结果显示与对照组相比转录水平Orai1下调、Stim1上调、Trpc1下调，翻译水平Orai1下调39.77％(p＜0.05)、Stim1上调122.03％(p＜0.05)、Trpc1无明显变化(p＞0.05)。
　　2.4 抑制SOCE后观察H2O2对胞内钙浓度的影响
　　2.4.1 针对H2O2引起改变的SOCC复合体主要组成成分，选取干扰Stim1来特异性抑制SOCE，荧光显微镜下观察近一半细胞携带荧光，免疫印迹法结果表明ShRNA干扰能够下调Stim1蛋白表达达30.15％(p＜0.05)。
　　2.4.2 SOCE抑制剂(ML-9)预处理及ShRNA干扰Stim1后，600μ MH2O2处理6小时观察EPCs胞内Ca2+浓度变化，结果显示抑制SOCE能够明显降低H2O2诱导的胞内Ca2+浓度升高。
　　3.H2O2增强SOCE对细胞活性及凋亡的影响
　　抑制SOCE后600μM H2O2处理6小时cck-8检测细胞活性及凋亡试剂盒检测凋亡发现，与H2O2组相比ML-9组和ShRNA干扰组细胞活性分别升高20.04％(p＜0.05)和27.68％(p＜0.05)，细胞凋亡分别降低16.45％(p＜0.05)和23.34％(p＜0.05)。
　　4.H2O2通过SOCE引起细胞凋亡机制的探讨
　　4.1 抑制SOCE对胞内ROS水平的影响
　　600μM H2O2处理6小时，胞内ROS水平明显升高(p＜0.05)，而用胞内ROS清除剂预处理组则细胞凋亡减少18.549％(p＜0.05)，说明ROS水平的升高会导致细胞凋亡增加，那么抑制SOCE所减缓的H2O2诱导的细胞凋亡是否跟胞内ROS水平相关呢？进一步我们抑制SOCE发现抑制SOCE可以明显降低H2O2诱导的胞内ROS水平的升高(p＜0.05)。
　　4.2 抑制SOCE对caspase家族的影响
　　为了探索H2O2通过SOCE诱导细胞凋亡的机制，首先检测H2O2对caspase家族的影响，结果显示它可以明显促进caspase家族成员9和12表达的上调(p＜0.05)。
　　4.3 抑制SOCE对内质网应激水平及线粒体损伤水平的影响
　　600μM H2O2处理6小时，能够明显上调caspase家族成员9和12的蛋白表达水平，说明H2O2处理可能激活了内质网应激凋亡途径和线粒体损伤凋亡途径，为了进一步证实这一推论，我们检测内质网应激及线粒体损伤相关指标，结果显示H2O2明显上调CHOP、BIP及cytochrome C的表达(p＜0.05)，降低线粒体膜电位(p＜0.05)，说明H2O2上调内质网应激水平及线粒体损伤水平。而抑制SOCE可以明显降低H2O2诱导的内质网应激水平及线粒体损伤水平的升高(p＜0.05)。
　　结论:
　　1.H2O2促进EPCs细胞活性的降低及细胞凋亡的增加。
　　2.H2O2促进EPCs上SOCE的增强。
　　3.H2O2部分通过上调Stim1的表达增强SOCE。
　　4.H2O2通过增强SOCE促进EPCs细胞活性的降低及细胞凋亡的增加。
　　5.H2O2通过增强SOCE激活了内质网应激凋亡途径及线粒体损伤凋亡途径。
　　6.抑制SOCE明显改善氧化应激诱导的EPCs细胞活性降低及凋亡增加的状况，因此，SOCE可能成为提高EPCs在氧化应激条件下生存能力和预防及治疗AS的有效靶点。

目录

声明

英文缩写词汇表

摘要

第一章 前言

第二章 氧化应激对EPCs细胞活性细胞凋亡及SOCE的影响

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 氧化应激增强SOCE对EPCs活性及凋亡的影响

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 氧化应激通过SOCE引起细胞凋亡机制的探讨

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

全文总结

参考文献

综述一 氧化应激与早期动脉粥样硬化及抗氧化治疗在其中的作用

综述二 EPCs在心血管疾病防治中的进展

个人成果

致谢