人ZP4重组子在真核系统中的表达及线粒体DNA多态性的调查

摘要

目的:研究目的之一:人类卵膜糖蛋白4(zona pellucidaⅣ，ZP4)基因的重组质粒构建、重组质粒在真核细胞中的表达及细胞内的定位，从而为后续ZP4与精子结合的研究提供基础。研究目的之二:探究中国北方人群线粒体DNA基因编码区多态性及与帕金森病(Parkinson's disease，PD)的关联性。
　　研究方法:合成含有人ZP4完整编码区的DNA，将合成的ZP4基因编码区DNA与真核表达质粒pCDNA3.1(+)进行重组，同时重组质粒中引入His序列标签。取构建的重组质粒转化感受态细胞，挑取单克隆菌落进行培养;从大肠杆菌中提取DNA，选择特异性限制性内切酶对重组质粒进行鉴定，最后采用DNA测序方法对插入序列的完整性及准确性进行鉴定。应用质粒DNA提取试剂盒分离纯化构建的pCDNA3.1(+)-ZP4-His重组质粒，转染HEK293细胞进行体外过表达研究;收集分别转染了pCDNA3.1(+)-His和pCDNA3.1(+)-ZP4-His的HEK293细胞及对应的培养基，采用免疫印迹技术(western blot)检测过表达的重组ZP4蛋白;同时，研究也对过表达ZP4的HEK293细胞进行固定，采用免疫荧光技术观察ZP4在HEK293中的亚细胞定位。
　　对于线粒体DNA多态性的分析，本研究收集了中国北方地区353例PD患者和389名健康个体的血液样本，采用酚氯仿方法抽提了所有样本的基因组DNA，应用复合PCR扩增和限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析方法，对人类线粒体DNA编码区ND1基因上T4216C、ND2基因上A4917G、ND4基因上A11084G、tRNA(L2)基因上A12308G、ND5基因上A13966G、tRNA(Thr)基因上G15928A共6个位点进行遗传多态性调查，针对所有位点的频率数据，本研究探讨了与PD的潜在相关性，并且对性别分层也进行了分析。
　　结果:以合成的人完整编码区DNA序列为目的片段，选择含有His标签序列的真核表达载体pCDNA3.1(+)，本研究成功构建了pCDNA3.1(+)-ZP4-His真核表达重组质粒。为了进一步探讨构建的ZP4重组质粒是否能够在真核细胞中表达，本研究将构建的重组质粒转染至HEK293细胞，转染后分别收集细胞及培养基，采用标签抗体和特异性抗体的Western blot分析后，结果显示转染人ZP4重组质粒的细胞成功表达了含有ZP4的融合蛋白，值得一提的是，培养基中也检测到了ZP4蛋白，提示重组ZP4蛋白不仅可以有效的在真核细胞中表达，而且该蛋白显示出明显的外分泌特征。为了进一步了解重组ZP4蛋白在细胞内的表达定位，对于过表达的重组蛋白本研究采用了免疫荧光技术进行分析，结果显示，特异性抗体结合的重组ZP4主要分布在细胞胞质内，提示为过表达的ZP4融合蛋白，但实验中并未见明显的细胞膜分布。此外，相对于人体卵细胞的ZP蛋白胞周围分布特征，本研究中检测到的为培养基中存在一定量的分泌，两种不同分布特性之间的关联需进一步研究证明。
　　本研究采用PCR和错配PCR-RFLP方法，复合扩增和酶切结合，成功地对人类mtDNA编码区上的6个遗传多态性位点进行了分型;基于得到的各位点的等位基因分型及频率数据，研究也获得了所有单倍型数据。其中，对性别进行分层后，发现女性群体中A11084G多态性位点等位基因G的频率和6个位点组成的单倍型(4216T-4917A-11084G-12308A-13966A-15928G)的频率PD组均较对照组高，且差异有统计学意义(P＜0.05)。而其它位点单倍型进行统计学分析，其多态性分布在中国北方PD组和对照组之间差异无统计学意义。
　　结论:1、成功构建了pCDNA3.1(+)-ZP4-His重组质粒并在HEK293细胞中高效表达;真核细胞表达的重组ZP4蛋白呈现出外分泌的特征。2、成功对人类mtDNA编码区6个SNPs进行了分型，并获得了相关的遗传学数据;在中国北方群体中未提示这6个SNPs为PD的易感因子;但A11084G位点A到G的突变可能与中国北方女性群体PD发病相关。

目录

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摘要

英文缩略语

第一部分：人ZP4重组质粒的构建及在真核系统中的表达

1 前言

2 材料和方法

2．1 研究对象

2．2 实验材料

2．3 实验方法

3 实验结果

3．1 pCDNA3．1(+)-ZP4-His重组质粒的构建

3．2 人重组ZP4蛋白在真核细胞中表达

4 讨论

4．1 原核和真核两种表达系统的比较

4．2 ZP4的重组子研究及表达

第二部分：中国北方帕金森病患者与线粒体编码区基因SNPs的相关性研究

1 前言

2．1 研究对象

2．2 实验材料

2．3 实验方法

2．4 统计学分析

3 结果

3．1 线粒体编码区6个位点的复合PCR-RFLP分型

3．2 中国北方PD和正常群体线粒体编码区6个SNP的遗传多态性分布及相关性分析

3．3 A4961C的鉴定

4 讨论

4．1 mtDNA编码区SNP对PD发生的潜在影响

4．2 mtDNA编码区SNP频率分布存在种族差异及与PD的关联性

5 结论

本研究创新型的自我评价

参考文献

综述 卵膜糖蛋白与精子结合的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历