肌动蛋白结合蛋白TAGLN2在甲状腺乳头状癌发生发展中的作用及机制研究

摘要

目的：甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常见的内分泌恶性肿瘤，且其发病率逐年升高。虽然PTC总体预后较好，但容易复发和淋巴结转移，这严重影响患者的生存预后。因此，进一步探索研究与PTC恶性生物学特征相关的因素，揭示PTC发生发展的相关分子机制，对寻找用于PTC的早期诊断、治疗及判断预后的干预靶点，改善病人生存及预后具有重要意义。细胞骨架结构和功能的改变是导致肿瘤发生发展的一个重要因素。肌动蛋白是细胞骨架的关键成分，它通过与肌动蛋白结合蛋白相互作用，调节细胞骨架重构，继而参与细胞运动、增殖及凋亡等生命过程。TAGLN2(Transgelin-2)是一种重要的肌动蛋白结合蛋白，其唯一的功能域CH(calponin homolog)结构域可以通过与肌动蛋白结合，参与细胞骨架重构，从而参与肿瘤发生发展。目前许多人类恶性肿瘤中均发现TAGLN2过度表达，且沉默TAGLN2后可以使癌细胞增殖、迁移和侵袭能力减弱，细胞凋亡能力增加。因此，TAGLN2可能是一个潜在的肿瘤干预治疗靶点。但是TAGLN2在PTC发生发展中的生物学功能及预后价值尚不清楚。本课题对TAGLN2在PTC发生发展中的作用及相关分子调控机制进行了研究。
　　方法：⑴收集74例甲状腺乳头状癌患者的癌组织和癌旁2cm甲状腺正常组织（经病理切片证实未发现癌细胞）。应用免疫组织化学(IHC，Immunohistochemistry)、实时定量PCR(q-PCR，real-time quantitative polymerase chainreaction)以及Western Blot蛋白印迹检测PTC癌组织和配对癌旁正常组织中TAGLN2蛋白及mRNA的表达情况，并分析TAGLN2异常表达与PTC病人临床病理特征之间的关系。⑵培养甲状腺乳头状癌细胞系，通过慢病毒转染沉默TAGLN2基因的表达并构建稳定转染细胞株。然后Western及实时定量PCR检测TAGLN2蛋白及mRNA表达水平评估转染效率;通过MTT法检测沉默TAGLN2对PTC细胞增殖能力的影响;Transwell迁移侵袭实验检测沉默TAGLN2对PTC细胞迁移、侵袭能力的影响;7-amino-actinomycin D(7-AAD)染色法检测沉默TAGLN2对PTC细胞凋亡能力影响;碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)法检测干扰TAGLN2基因对PTC细胞周期的影响。⑶Western blot蛋白印迹法检测下调TAGLN2表达后细胞周期蛋白CyclinD1、抗凋亡因子Bcl-2及侵袭转移相关蛋白MMP-2/MMP-9的表达，并检测信号分子p-Akt、Akt、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达水平评估增殖转移相关的PI3K/Akt及MAPK/ERK信号通路激活情况;同时，免疫沉淀(IP，immunoprecipitation)联合液相色谱质谱技术(LC-MS/MS， liquid chromatographycoupled with tandem mass spectrometry)筛查TAGLN2互作蛋白。
　　结果：①IHC结果显示，癌组织中TAGLN2表达阳性率为74.3％(55/74)，癌旁组织仅为32.4％(24/74)，明显低于癌组织(p＜0.001);Western及q-PCR结果显示癌组织中TAGLN2蛋白及mRNA相对表达量分别为0.520±0.180和2.463±1.030，明显高于癌旁组织（0.255±0.120和1.077±0.461，p＜0.001）;且其异常表达仅与PTC淋巴转移密切相关(p＜0.05)，而与患者年龄、性别，肿瘤大小、包膜侵犯及多灶性之间没有关系(p＞0.05)。②与未转染组(con)和空载体组(neg-shRNA)相比，沉默组(TAGLN2-shRNA)中TAGLN2蛋白及mRNA相对表达水平明显降低(p＜0.05)，而未转染组和空载体组间差异无明显统计学意义(p＞0.05)。MTT法检测沉默TAGLN2基因对PTC细胞增殖能力影响:K1、TPC-1和BCPAP细胞沉默组比未转染组细胞增殖能力明显降低。Transwell检测干扰TAGLN2基因对PTC细胞迁移侵袭能力的影响:对迁移细胞进行计数，K1细胞未感染组，空载体组及沉默组平均细胞数分别为210±14，209±34，107±14，TPC-1细胞为259±34，238±51，138±20，BCPAP细胞分别为285±36，263±35及150±8;对侵袭细胞计数，K1细胞未感染组，空载体组及沉默组平均细胞数分别为112±7，101±13，50±5，TPC-1细胞为141±12，144±7，70±5，BCPAP细胞分别为179±37，165±42及58±5，沉默TAGLN2后PTC细胞迁移及侵袭能力明显减弱(p＜0.05)，而未转染组与空载体组组间差异无统计学意义(p＞0.05)。7-AAD检测发现干扰TAGLN2基因使PTC细胞凋亡能力增加:未感染组，空载体组及沉默组K1细胞凋亡率分别为2.853±0.146％，2.810±0.111％和16.147±2.451％，TPC-1细胞为3.713±0.375％，3.350±0.303％和33.040±0.867％，BCPAP细胞为2.670±0.141％，2.603±0.190％和9.863±1.184％。碘化丙啶染色检测沉默TAGLN2基因对PTC细胞周期的影响:结果显示，沉默组与未转染组和空载体组相比，K1细胞G1期增多(46.900±4.243％ vs47.393±3.206％ vs64.349±0.953％)(p＜0.05)，S期明显减少(39.483±5.882％ vs38.728±4.991％ vs22.076±2.384％)(p＜0.05)，G2期无变化差异(13.613±1.651％ vs13.875±1.778％ vs13.573±1.669％)(p＞0.05); TPC-1细胞G1期增多(30.695±3.594％ vs32.954±1.713％ vs40.773±3.984％)(p＜0.05),S期减少(29.543±2.148％ vs27.310±3.334％ vs20.810±1.009％)(p＜0.05)，G2期无明显变化(39.763±4.756％ vs39.734±3.816％ vs38.415±3.504％)(p＞0.05);BCPAP细胞G1期显著增多(25.705±2.219％vs26.375±3.170％vs54.100±4.959％)(p＜0.05)，S期明显减少(60.305±2.624％vs60.723±1.732％vs34.478±1.370)(p＜0.05)，G2期无明显变化(13.988±4.213％ vs12.990±4.459％ vs11.424±3.702％)(p＞0.05)。说明沉默TAGLN2诱导PTC细胞发生G1期阻滞，抑制癌细胞生长增殖。③Western blot用于检测下调TAGLN2基因后，细胞周期蛋白CyclinD1、抗凋亡蛋白Bcl-2及转移相关蛋白MMP-2/MMP-9表达水平的变化。结果显示，K1细胞中沉默组CyclinD1蛋白相对表达水平(0.355±0.074)明显低于未转染组(0.745±0.154，p=0.001)和空载体组(0.782±0.189，p=0.001); Bcl-2蛋白在沉默组中表达水平(0.328±0.142)明显低于未转染组(0.977±0.183，p=0.002)和空载体组(0.916±0.127，p=0.003);沉默组MMP-2和MMP-9蛋白的相对表达(0.256±0.056，0.394±0.176)也明显低于未转染(0.625±0.021，p=0.001;0.700±0.161，p=013)和空载体组(0.623±0.116，p=0.001;0.734±0.162，p=0.007)。TPC-1细胞未转染组、空载体组和沉默组中CyclinD1蛋白相对表达水平分别为0.883±0.124、0.922±0.180、0.487±0.209，沉默组明显低于未转染组(p=0.004)和空载体组(p=0.002);未转染组、空载体组和沉默组中Bcl-2蛋白表达水平分别为1.040±0.235、1.068±0.233、0.378±0.219，沉默组明显低于未转染(p=0.007)和空载体组(p=0.007):另外沉默组中MMP-2和MMP-9蛋白相对表达水平分别为0.290±0.181和0.516±0.124，明显低于未转染组(0.717±0.185，p=0.009;0.812±0.143，p=0.005)和空载体组(0.603±0.275，p=0.043;0.825±0.136，p=0.003)。BCPAP细胞TAGLN2沉默组CyclinD1蛋白和Bcl-2蛋白的相对表达水平分别为0.297±0.135和0.394±0.104，明显低于未转染(0.561±0.084，p=0.016;0.932±0.208，p=0.008)和空载体组(0.623±0.205，p=0.005;0.841±0.184，p=0.018)，沉默组MMP-2和MMP-9蛋白相对表达水平分别为0.379±0.160和0.247±0.124，明显低于未转染组(0.873±0.224，p=0.027;0.697±0.159，p=0.001)和空载体组(0.844±0.233，p=0.034;0.688±0.177，p=0.001)。而未转染组和空载体组组间CyclinD1、Bcl-2、MMP-2和MMP-9蛋白表达差异无明显统计学意义(p＞0.05)。除此之外，通过Western blot对PTC细胞未感染组，空载体组及沉默组中Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达差异进行检测，观察沉默TAGLN2基因对PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路激活的影响:K1细胞中沉默组p-Akt和p-ERK1/2蛋白相对表达水平均明显低于未转染组和空载体组(0.332±0.112 vs0.861±0.151 vs0.729±0.124,0.575±0.076 vs1.167±0.143 vs1.005±0.186;p＜0.001), TPC-1细胞TAGLN2基因沉默组p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白的相对表达水平分别为0.564±0.226和0.537±0.075，明显低于未转染(1.135±0.236，p=0.004;0.945±0.136，p=0.000)和空载体组(1.151±0.285，p=0.003;1.070±0.146，p=0.000)，BCPAP细胞沉默组p-Akt蛋白相对表达为0.493±0.214，p-ERK1/2蛋白相对表达水平为0.501±0.223，明显低于未转染(0.867±0.179，p=0.034;0.855±0.068，p=0.012)和空载体组(0.861±0.326，p=0.037;0.967±0.230，p=0.002)，而三种细胞未感染组，空载体组及沉默组中Akt和ERK1/2蛋白表达水平无明显差异(p＞0.05)。另外，免疫沉淀-质谱联用发现TAGLN2可能与ACTB、MYH9、ARP-2、ARP-3等蛋白互作。
　　结论：⑴TAGLN2的蛋白和mRNA在PTC癌组织中的表达明显高于癌旁组织，并且与PTC的淋巴转移密切相关。⑵沉默TAGLN2基因明显抑制PTC细胞增殖、迁移及侵袭能力，同时促进细胞凋亡及细胞周期阻滞。TAGLN2在促进PTC生长及转移过程中发挥着重要作用。⑶下调TAGLN2基因可能通过抑制PI3K/Akt及ERK1/2信号通路介导的CyclinD1、Bcl-2、MMP-2及MMP-9蛋白的表达，参与调节PTC细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡等恶性生物学行为。另外，在PTC转移过程中，可能还涉及TAGLN2参与侵袭性伪足的形成过程。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：TAGLN2在甲状腺乳头状癌中的表达及临床意义

1 前言

2．1 材料

2．2 研究对象及分组

2．3 实验方法

3 结果

3．1 TAGLN2在PTC癌组织和癌旁组织中的表达

3．2 TAGLN2表达与PTC临床病理特征之间的关系

4 讨论

5 结论

第二部分：慢病毒转染干扰TAGLN2基因对甲状腺乳头状癌细胞恶性生物学行为的影响

1 前言

2．1 主要试剂及仪器

2．2 研究对象及分组

2．3 实验方法

3 结果

3．1 TAGLN2基因抑制效率检测

3．2 验证稳定转染细胞株中TAGLN2蛋白及mRNA的表达

3．3 沉默TAGLN2基因抑制PTC细胞增殖

3．4 下调TAGLN2表达抑制PTC细胞迁移侵袭能力

3．5 干扰TAGLN2基因表达促进PTC细胞发生凋亡

3．6 干扰TAGLN2基因表达影响PTC细胞周期

4 讨论

5 结论

第三部分：TAGLN2参与调节甲状腺乳头状癌发生转移的分子机制研究

1 前言

2．1 主要试剂及仪器

2．2 研究对象及分组

2．3 实验方法

3 结果

3．1 下调TAGLN2对增殖、转移相关蛋白的表达影响

3．2 TAGLN2下调对相关信号通路激活的影响

3．3 免疫沉淀-质谱联用筛选TAGLN2互作蛋白

4 讨论

5 结论

本论文创新性的自我评价

参考文献

综述 肌动蛋白结合蛋白Transgelin-2在肿瘤发生发展中的研究

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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