自噬在糖基化终末产物抑制破骨细胞形成和功能中的作用

摘要

目的:糖尿病性骨质疏松严重影响人们的健康和生活，糖尿病或高血糖状态与糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)的形成密切相关，而不同浓度的AGEs对成骨细胞和破骨细胞的作用不尽相同，并且可导致骨强度降低、骨脆性增加以及骨质疏松。但是，明确AGEs对破骨细胞形成和功能的影响以及明确自噬在AGEs影响破骨细胞形成和功能中的作用对于糖尿病性骨质疏松的治疗有一定的意义。
　　方法:以RAW264.7细胞作为破骨细胞的前体细胞，在铺板后第二天加入RANKL(receptor activator for nuclear factor-B ligand)和M-CSF(macrophagecolony-stimulating factor)等诱导破骨细胞产生。观察和检测不同浓度AGEs作用下破骨细胞的形成和功能，并用氯喹和雷帕霉素分别抑制和激活自噬后，观察破骨细胞的形成和功能。1、通过CCK-8（Cell Counting Kit-8）试剂盒检测不同AGEs浓度下RAW264.7细胞的细胞活力;2、通过TRAP(Tartrate resistant acid phosphatase)染色鉴定破骨细胞的形成，并检测不同AGEs浓度以及自噬对破骨细胞形成的影响;3、通过western blot检测不同AGEs浓度下LC3、p62以及Cathepsin K等蛋白的表达差异;4、通过LC3免疫荧光染色鉴定细胞内的自噬强度，MDC(Monodansylcadaverine)免疫荧光试验作为一个辅助试验用以检测细胞内自噬泡的形成;5、通过利用Osteo Assay Surface检测不同干预因素下的骨吸收差异。
　　结果:1、未发现0mg/l（对照组），50 mg/l，100 mg/l，150 mg/l，200 mg/l的AGEs以及100mg/l的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)对RAW264.7细胞有毒性作用;2、0mg/l-200mg/l的AGEs浓度内，随着AGEs浓度的升高，Cathepsin K的表达量降低，100mg/l的AGEs与对照组相比，TRAP染色后破骨细胞的形成数量减少，骨吸收面积减少;3、在氯喹的作用下，TRAP染色后破骨细胞的形成较对照组减少且骨吸收面积减少，而在雷帕霉素的作用下，TRAP染色后破骨细胞的形成较对照组增加且骨吸收面积增加;4、0mg/l-200mg/l的AGEs浓度下，随着AGEs浓度的升高，LC3Ⅱ/β-actin数值降低而p62/β-actin数值增加，100mg/l的AGEs与对照组相比，LC3及MDC免疫荧光数量减少。
　　结论:1、0mg/l-200mg/l的AGEs浓度内，高浓度的AGEs抑制破骨细胞的形成和功能，并且抑制细胞内的自噬水平;2、自噬可以促进破骨细胞的形成及功能;3、AGEs抑制破骨细胞形成及功能的机制很可能与抑制自噬有关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 研究对象和分组

2．3 实验方法

2．3．1 细胞培养

2．3．2 AGEs的制备与成分鉴定

2．3．3 细胞活力试验

2．3．4 TRAP染色

2．3．5 蛋白印迹杂交(Western Blot)

2．3．6 MDC免疫荧光试验

2．3．7 LC3免疫荧光试验

2．3．8 骨吸收试验

2．4 统计学分析

3．1 AGEs的制备与成分鉴定

3．2 细胞活力实验

3．3 TRAP染色

3．4 Western blot

3．5 MDC细胞免疫荧光

3．6 LC3细胞免疫荧光

3．7 骨吸收试验

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

文献综述 糖基化终末产物通过自噬相关分子影响破骨细胞分化和功能

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历