约氏疟原虫感染TLR2/TLR7活化效应特点的研究

摘要

目的:疟原虫为单细胞寄生生物。当疟原虫感染宿主时，TLRs可识别疟原虫的病原相关的模式分子(PAMP)，将把病原入侵的信息传递给机体，激活免疫系统发挥抵抗感染作用，是机体抵御感染性病的第一道保护屏障。研究表明，TLR2在疟疾感染过程中，它能识别疟原虫的磷脂酰肌醇(PI)，主要表达于髓样树突状细胞(mDC)。TLR7具体识别疟原RNA，主要表达在浆样树突状细胞(pDC)，TLR7被其配体激活后，通过下游接头蛋白分子MyD88将激活信号向下游传递，最终激活转录因子NF-κ B，从而产生多种促炎性细胞分化，参加体液免疫或细胞免疫应答。TLR2、TLR7其激活能够活化树突状细胞(Dendritic Cells，DC)，上调细胞表面分子如共刺激分子和MHCⅡ类分子的表达，同时抑制DC的凋亡。《Nature》刊发的文章已明确证实，DC实现对T细胞的激活效应主要取决于TLRs的存在，DC正是决定Th细胞应答形式、强度和效应的关键因素，TH1、TH2、TFH细胞能有效遏制寄生虫感染，它们分别在疟疾感染不同阶段发挥效应，其中感染早期建立的TH1型细胞免疫应答可显著提高吞噬细胞的吞噬能力和杀伤活性，进而控制病原虫的指数性增殖，随后，TFH、TH2细胞不仅辅助B细胞活化、成熟增殖并产生特异性抗体可有效灭除病原体，还可促进B细胞分化为记忆B细胞(Bm)。本研究通过创建约氏疟原虫Plasmodiumyoelii感染BALB/c小鼠模型，观察疟疾感染早期CD4+T细胞及其亚群的活化状况、应答模式以及感染后期抗体的分泌水平以及记忆性T、B细胞的增殖情况，明确TLRs介导DC调控免疫记忆建立和维持的作用机制，以期为研制开发有效的疟疾疫苗提供新的靶点和思路。
　　研究方法:创建约氏疟原虫Plasmodiumyoelii感染BALB/c小鼠的模型，通过流式细胞术、real-time PCR、Elisa方法观察疟疾感染早期CD4+T细胞及其亚群的活化状态、应答模式以及感染后期抗体的分泌水平及记忆性T、B细胞的增殖情况，明确TLRs介导DC调控免疫效应的维持和建立的作用及其原理。
　　结果:1、在P.y17XNL感染BALB/c小鼠模型中，TLR2激动剂Pam3CSK4可通过活化DC增强感染早期TH1、TFH型保护性免疫效应，从而使感染小鼠原虫血症水平降低，而未活化TH2型及调节性T细胞(Treg)引起的免疫应答。在感染10天后，可以促进记忆性T细胞、记忆B细胞的增殖，但与对照组相比无明显统计学差异。2、在P.y17XNL感染BALB/c小鼠模型中，TLR7激动剂Loxorbine可通过活化DC增强感染早期TH1、TH2、TFH型保护性免疫应答，从而使感染小鼠原虫血症水平降低，而对Treg细胞数量影响不大。在感染10天后，可以促进记忆性T细胞、记忆B细胞的增殖，但与对照组相比无明显统计学差异。
　　结论:在P.y17XNL感染BALB/c小鼠模型中，TLR2激动剂Pam3CSK4、TLR7激动剂Loxorbine可通过诱导DC活化，促进有效的TH1、TFH免疫效应，在感染早期发挥保护性免疫作用，并降低原虫血症水平。同时，TLR2、TLR7激动剂还可促进T、B细胞免疫记忆的产生，但是差异不显著。此外，TLR7激动剂还可以促进TH2型免疫应答，但是TLR2激动剂可能不活化TH2型细胞和调节性T细胞。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1 实验材料与主要仪器

2．1．1 疟原虫

2．1．2 实验动物

2．1．3 主要试剂

2．1．4 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 分组及建立鼠疟模型

2．2．2 实验动物处理

2．2．3 流式细胞术确定不同鼠疟模型初期免疫效应差异

2．2．4 确定不同鼠疟模型免疫记忆建立与维持的差异

2．2．5 脾细胞培养

2．2．6 细胞因子分析

2．2．7 Real-time PCR RNA水平的检测

2．2．8 数据分析

3 实验结果

3．1 TLR2／7受体活化对感染小鼠原虫血症水平的影响

3．2 TLR2／7受体活化对感染小鼠TLR2／7的影响

3．3 TLR2／7受体活化处理对感染小鼠脾脏中DC及其亚群百分率的影响

3．4 TLR2／7受体活化对小鼠脾细胞中效应T细胞的影响

3．5 TLR2／7受体活化对小鼠脾细胞中TH1型细胞的影响

3．6 TLR2／7受体活化对感染小鼠脾细胞中TH2型细胞的影响

3．7 TLR2／7受体活化对感染小鼠脾细胞中TFH细胞的影响

3．8 TLR2／7受体活化对感染小鼠脾细胞中Treg细胞的影响

3．9 TLR2／7受体活化对小鼠脾细胞中中枢(TCM)／效应(TEM)记忆性T、记忆B／分泌IgG浆细胞的影响

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 TOLL样受体在疟疾免疫中的研究进展及其应用

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历