去唾液酸糖蛋白受体介导的新型肝细胞靶向磁共振对比剂(Fe-HSA-LA)的体外实验研究

摘要

目的:本研究采用自主设计的去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor，ASGPR)介导的纳米铁颗粒(Fe-HSA-LA)进行体外实验，用以探讨其作为肝细胞靶向磁共振对比剂（magnetic resonance contrast agents，MR CAs）的可行性。
　　材料与方法:聚乙二醇(polyehtylene glycol，PEG)包被的超微型超顺磁性氧化铁颗粒（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）偶联乳糖酸(lactoseacid，LA)与人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)，合成为去唾液酸糖蛋白受体介导的肝细胞靶向磁共振对比剂(Fe-HSA-LA)，并且通过磁共振扫描检测纳米铁颗粒的T2弛豫率。
　　采用表达ASGPR的大鼠正常肝细胞(BRL3A cells)作为靶细胞和ASGPR缺陷的小鼠结肠癌细胞(colon26 cells)作为对照细胞，同时采用PEG包被的超微型超顺磁性氧化铁颗粒(PEG-USPIO)作为对照，通过几种方法评价Fe-HSA-LA纳米铁颗粒的肝细胞靶向性。另外将铁浓度范围为0-200μg Fe/mL的纳米铁颗粒分别与两种细胞孵育24小时，采用WST-8细胞计数试剂盒(CCK-8)评估纳米铁颗粒的细胞毒性。
　　以10和50μg Fe/mL浓度的Fe-HSA-LA和PEG-USPIO分别孵育BRL3A细胞及colon26细胞后经普鲁士蓝染色，分别收集每组染色后的标记细胞，通过原子吸收光谱法（atomic absorption spectroscopy, AAS）测定细胞结合铁量。对系列浓度的Fe-HSA-LA和PEG-USPIO孵育的BRL3A细胞及colon26细胞悬液进行MR T2加权成像及T2 map成像，研究MR信号改变与纳米铁颗粒浓度的关系，并利用AAS测定各组标记细胞的结合铁量，研究细胞结合铁量与纳米铁颗粒浓度的关系，用以评价纳米铁颗粒的靶向能力。
　　所有数据采用GraphPad Prism7.0软件进行统计分析。数据中的计量资料以均数±标准差表示。利用析因设计分析方法对细胞存活率结果进行方差分析，用以评价两种纳米铁颗粒的细胞毒性。采用独立样本t检验方法比较标记细胞的结合铁量，采用Pearson相关分析方法进行细胞内铁含量与R2之间相关性分析。P＜0.05认为差异具有统计学意义。
　　结果: Fe-HSA-LA和PEG-USPIO两种纳米铁颗粒的T2弛豫率分别为168.4mM-1s-1和416.3mM-1s-1。
　　细胞毒性实验表明:随着两种纳米铁颗粒的浓度增加，BRL3A细胞存活率降低(P＜0.05)。用小于或等于50μg Fe/mL浓度的纳米铁颗粒分别孵育BRL3A和colon26细胞时，Fe-HSA-LA纳米铁颗粒孵育组细胞存活率均达到95％以上，PEG-USPIO纳米铁颗粒孵育组细胞存活率均维持在80％以上。Fe-HSA-LA纳米铁颗粒对BRL3A细胞和colon26细胞毒性作用低于PEG-USPIO的细胞毒性作用。
　　普鲁士蓝染色和AAS检测结果显示:BRL3A细胞和colon26细胞与Fe-HSA-LA和PEG-USPIO纳米铁颗粒的结合能力不同。随着两种纳米铁颗粒孵育浓度的增加，两种标记细胞内铁含量随之增加。但是，在相同孵育浓度下，BRL3A细胞结合的Fe-HSA-LA含量最高(P＜0.05)。
　　磁共振检测和AAS检测结果显示:随着Fe-HSA-LA和PEG-USPIO孵育浓度的增加，标记细胞的T2WI信号逐渐减低，其内铁含量逐渐增加。当孵育的纳米颗粒的铁浓度等于或高于3.125μg Fe/mL时，在相同铁浓度孵育下，Fe-HSA-LA标记的BRL3A细胞的信号降低最明显，同时细胞内的铁含量最高(P＜0.05)。标记细胞R2值和细胞内铁含量之间具有良好相关性。
　　结论:我们设计了可以有效靶向大鼠正常肝细胞（BRL3A细胞）的磁共振对比剂Fe-HSA-LA。基于体外实验的结果，表明去唾液酸糖蛋白受体介导的磁共振对比剂Fe-HSA-LA对细胞毒性作用小，具有良好的生物相容性。同时，Fe-HSA-LA纳米颗粒对BRL3A细胞具有良好的靶向特异性。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要试剂和仪器

2．1．1 主要实验试剂

2．1．2 主要实验仪器

2．1．3 实验所用细胞系

2．2 实验方法

2．2．3 BRL 3A细胞及colon26细胞体外培养

2．2．4 纳米铁颗粒与细胞共孵育的细胞毒性检测

2．2．5 纳米铁颗粒与细胞共孵育的普鲁士蓝染色

2．2．6 纳米铁颗粒标记细胞体外磁共振成像

2．2．7 统计学分析

3 结果

3．2 Fe-HSA-LA和PEG-USPIO纳米铁颗粒T：弛豫率测定结果

3．3 两种纳米铁颗粒标记细胞体外实验结果

3．3．1 纳米铁颗粒与细胞共孵育的细胞毒性检测结果

3．3．2 纳米铁颗粒与细胞共孵育的普鲁士蓝染色结果

3．3．3 纳米铁颗粒标记细胞的体外磁共振成像结果

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 去唾液酸糖蛋白受体介导的肝细胞靶向MRI对比剂的研究进展

致谢

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