RSV感染鼠肺组织内IL-33来源细胞及其产生机制的研究

摘要

目的:哮喘是由多种细胞及炎性因子共同参与的免疫性疾病。固有免疫细胞包括嗜酸粒细胞以及适应性免疫细胞如Th2细胞均参与哮喘的发生发展。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)与哮喘的关系一直受到研究学者的密切关注。婴幼儿RSV感染后100％出现呼吸困难、喘息、哮鸣以及紫绀等哮喘样症状。然而，尽管有研究表明RSV感染可能通过诱导Th2细胞分泌更多的Th2型细胞因子进而诱发或加重哮喘，但常规的哮喘治疗药物对其治疗效果不佳，提示在RSV感染诱发哮喘的发生发展中存在着不同于Th2型细胞的某些致病机制或途径。那么其他免疫细胞，尤其是肺泡巨噬细胞，树突状细胞这类存在于肺组织局部的重要的固有免疫细胞，在RSV病毒感染诱发的哮喘样症状的发生中具有怎样的生物学作用及其作用机制如何，目前尚不清楚。
　　IL-33是新近发现的IL-1家族细胞因子。研究显示IL-33/ST2途径在超敏反应性疾病的形成和发作中占有重要地位。严重哮喘患者肺支气管上皮细胞高水平表达IL-33 mRNA，IL-33通过与Th2细胞表面ST2受体结合，诱导其分泌Th2型细胞因子。用抗IL-33或抗ST2单克隆抗体处理小鼠可抑制变应原特异性Th2细胞的活化，减轻嗜酸性粒细胞肺浸润，降低气道高反应性。以上结果提示IL-33可能参与介导哮喘的发生和发展。
　　体内多种细胞分泌IL-33。除上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、神经胶质细胞等这类非免疫细胞外，巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞等亦可在某些刺激因素作用下分泌IL-33。研究发现在流感病毒H3N1诱导的哮喘鼠模型中，肺泡巨噬细胞表达IL-33明显增加，进而加重了哮喘的发生发展。
　　那么在RSV感染诱发的哮喘样症状的发生过程中，IL-33是否亦参与其中？RSV感染模型鼠肺组织局部的固有免疫细胞，如巨噬细胞和树突状细胞是否也可在RSV感染的刺激下分泌IL-33?其合成机制如何？诸多问题亟需解决。本研究利用HE染色、荧光实时定量技术，流式细胞术，免疫印迹等实验方法，旨在证实细胞因子IL-33参与RSV感染诱发的哮喘样症状发生发展的过程，明确RSV感染模型鼠肺组织局部分泌IL-33的固有细胞类型，并进一步探讨其分泌IL-33的机制。
　　研究方法:1、HEp-2细胞增殖人类呼吸道合胞病毒A2型，采用30％蔗糖超速离心法分离纯化病毒粒子，于-80℃冰箱保存备用。由组织细胞半数感染量（50％tissue culture infections dose，TCID50）表示病毒滴度。
　　2、实验组由RSV病毒悬液(1×107 p.fu.RSV/20μl)经鼻粘膜感染BALB/c小鼠。对照组由同等体积的无菌PBS溶液经鼻黏膜感染BALB/c小鼠。
　　3、0.05ml7.2％水合氯醛腹腔注射深度麻醉BALB/c小鼠，心脏灌流去除肺血管内血细胞后摘取肺组织至预冷的PBS中冲洗。收集肺泡灌洗液，重悬细胞沉淀，计数细胞总数并制备细胞涂片，Diff-Quick染色后显微镜下随机选择视野，计数200个细胞，依据形态学特点分别计数中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数量。
　　4、收集肺组织，多聚甲醛中固定BALB/c小鼠肺组织，梯度乙醇逐级脱水，随后经过石蜡包埋、切片后进行HE染色，光学显微镜观察肺组织形态结构及炎症反应情况。
　　5、用含有消化酶的1640培养液，37℃恒温摇床消化肺组织60～90分钟后经过300目钢网收集小鼠肺组织单细胞悬液。
　　6、调整小鼠肺组织细胞悬液浓度，用FITC-anti-CD45 mAb、APC-anti-CD11cmAb及PE/cy7-anti-F4/80 mAb的抗体标记肺组织细胞，利用流式细胞技术监测RSV感染小鼠肺组织局部肺泡巨噬细胞、树突状细胞、间质巨噬细胞数量变化，此外，利用流式细胞术内因子染色法检测IL-33+肺泡巨噬细胞、IL-33+间质巨噬细胞、IL-33+树突状细胞数量的改变。
　　7、调整肺组织单细胞悬液浓度，利用流式细胞分选技术及磁珠分选技术分离CD11 c+F4/80+的肺泡巨噬细胞;F4/80磁珠阴性选择后在经过CD11c磁珠阳性选择得到CD11 c+F4/80-的细胞为肺组织树突状细胞;CD11c磁珠阴性选择后在经过F4/80磁珠阳性选择得到CD11c-F4/80+的细胞即为肺组织间质巨噬细胞。
　　8、分选RSV感染小鼠肺组织局部固有免疫细胞，提取其总RNA逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR技术检测IL-33 mRNA的改变。同时检测肺组织局部固有免疫细胞表面TLR3、TLR4、TLR7 mRNA的改变。分选RSV感染小鼠肺组织固有免疫细胞，1×105细胞/孔平铺于96孔板，加入TLR3、TLR7特异性激活剂或者抑制剂，体外共培养24小时后，收集细胞，提取总RNA，逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR技术检测IL-33的表达水平。
　　9、磁珠分选肺泡巨噬细胞，提取总RNA，逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR技术检测RSV感染后肺泡巨噬细胞表达p38，JNK，ERK，NF-κB mRNA的水平。巨噬细胞系RAW264.7体外培养，对数生长期RSV感染，PCR技术及免疫印迹技术检测RAW264.7细胞内p38，JNK，ERK，NF-κB mRNA及其蛋白水平的改变。利用免疫印迹的技术检测巨噬细胞内JNK，ERK，p38，NF-κB等信号蛋白磷酸化水平，并利用阻断实验验证JNK，ERK，p38，NF-κB是否参与RSV介导的巨噬细胞分泌IL-33的过程。
　　结果:1、成功建立RSV急性感染鼠模型，实时荧光定量PCR技术检测发现RSV感染的BALB/c小鼠肺组织内IL-33 mRNA的表达明显升高，HE病理组织染色见肺组织局部有大量炎性细胞浸润。用抗IL-33的单克隆抗体预处理RSV感染鼠，发现BALB/c小鼠肺组织局部炎性反应减轻，嗜酸性粒细胞数量及浸润明显下降，提示IL-33参与RSV介导急性非过敏性哮喘的发生发展。
　　2、利用流式细胞术发现RSV感染鼠肺组织内肺泡巨噬细胞数量及IL-33+的肺泡巨噬细胞有明显升高。利用流式细胞分选技术及磁珠分选技术分选RSV感染鼠肺泡巨噬细胞，实时荧光定量PCR技术检测到肺泡巨噬细胞内IL-33 mRNA的表达明显上升。此外，RSV体外感染巨噬细胞系RAW264.7细胞亦检测到IL-33 mRNA的高表达，提示肺组织局部的固有免疫细胞，尤其是肺泡巨噬细胞在RSV感染过程中可能是IL-33的重要来源细胞之一。
　　3、利用流式细胞染色技术检测RSV感染鼠肺组织内树突状细胞的数量，结果发现模型鼠肺组织内树突状细胞数量没有明显变化，然而IL-33+的树突状细胞数量呈现明显上升趋势。磁珠分选技术分选RSV感染鼠肺组织局部树突状细胞，利用实时荧光定量PCR技术发现RSV感染诱导树突状细胞内IL-33 mRNA的高表达。此外，RSV体外感染树突状细胞系DC2.4同样检测到其IL-33 mRNA的高表达，提示在RSV感染过程中，肺组织局部树突状细胞亦是IL-33的来源细胞之一。
　　4、同样采用流式细胞术检测了肺间质巨噬细胞数量的变化，结果发现在RSV感染过程中肺组织局部间质巨噬细胞数量及IL-33+的间质巨噬细胞数量均没有明显变化，说明肺间质巨噬细胞在RSV感染过程中不是IL-33的来源细胞。
　　5、利用实时荧光定量技术检测RSV感染鼠肺组织局部固有免疫细胞内TLR表达的变化。结果显示，肺泡巨噬细胞及肺间质巨噬细胞内表达TLR3，TLR4，TLR7的表达明显升高，尤其是TLR7的升高最为明显，提示在RSV感染过程中，肺固有免疫细胞可能通过TLR7或者TLR3的途径介导IL-33的表达。
　　6、利用TLR受体激活剂及阻断剂检测TLR是否在RSV介导IL-33在固有免疫细胞中发挥作用。在TLR3，TLR7激活剂的刺激下，RSV感染的肺泡巨噬细胞及树突状细胞分泌IL-33的水平明显升高。此外，TLR3及TLR7的特异性阻断剂成功阻断了肺泡巨噬细胞及树突状细胞IL-33 mRNA的表达，提示肺泡巨噬细胞、树突状细胞通过TLR3或者TLR7的途径参与RSV介导急性哮喘的发生发展。
　　7、磁珠分选RSV感染鼠肺组织局部肺泡巨噬细胞，利用实时荧光定量PCR技术发现JNK1/2 mRNA的表达明显上升;RSV体外感染巨噬细胞系RAW264.7细胞同样检测到JNK1/2 mRNA及其蛋白的高水平表达。此外，免疫印迹技术监测到RSV感染介导巨噬细胞内JNK蛋白分子的磷酸化，提示JNK参与RSV介导肺泡巨噬细胞分泌IL-33的过程。JNK的特异性阻断剂成功降低了RSV感染的巨噬细胞内IL-33的分泌水平，证实了以上实验结果。
　　8、同样采用实时荧光定量PCR技术及免疫印迹的方法，检测到RSV感染鼠肺组织肺泡巨噬细胞内p38及ERK1/2 mRNA的表达量明显升高;在RSV感染的巨噬细胞系RAW264.7细胞内同样检测到p38、ERK1/2 mRNA和蛋白的高水平表达。RSV感染亦活化了巨噬细胞内的p38、ERK磷酸化蛋白分子。此外，p38及ERK的特异性阻断剂成功阻断了IL-33在RSV感染的巨噬细胞内的表达，证实p38及ERK参与RSV介导的巨噬细胞分泌IL-33的过程。
　　9、利用实时荧光定量PCR技术及免疫印迹技术动态监测了NF-κB是否在RSV介导巨噬细胞表达IL-33的过程中发挥作用。结果发现，NF-κB无论在基因水平还是蛋白水平均没有明显变化;并且RSV感染并没有诱导巨噬细胞内NF-κB蛋白的磷酸化，说明在RSV介导肺泡巨噬细胞分泌IL-33的过程中NF-κB未发挥作用。
　　结论:1、肺泡巨噬细胞和树突状细胞是RSV感染过程中IL-33的主要来源细胞。2、RSV感染诱导肺泡巨噬细胞和树突状细胞表达IL-33的过程依赖于TLR3或者TLR7的途径。3、在RSV感染过程中，肺泡巨噬细胞依赖于TLR下游的MAPK而不是NF-κB信号通路介导的IL-33的表达。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：RSV感染鼠肺组织内IL-33的主要来源细胞及其机制的初步探究

1 前言

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果

3．2 肺泡巨噬细胞是IL-33的重要来源细胞

3．3 RSV病毒感染诱导肺树突状细胞分泌IL-33

3．4 肺间质巨噬细胞未参与RSV感染诱导IL-33分泌的过程

3．5 RSV感染鼠诱导肺泡巨噬细胞、间质巨噬细胞内TLRs活化

3．6 RSV诱导肺泡巨噬细胞、树突状细胞分泌IL-33依赖TLR3或TLR7途径

4 讨论

结论

第二部分： RSV感染诱导肺泡巨噬细胞分泌IL-33的过程依赖于MAPKs信号途径

5 前言

6．1 实验材料

6．2 实验方法

7 结果

7．1 巨噬细胞是IL-33的重要来源细胞

7．2 JNK信号蛋白在RSV介导巨噬细胞分泌IL-33过程中发挥重要作用

7．3 RSV感染活化巨噬细胞内p38蛋白参与IL-33的表达

7．4 ERK信号蛋白参与调控RSV感染介导巨噬细胞内IL-33的分泌

7．5 RSV介导巨噬细胞内IL-33的表达不依赖于NF-κB蛋白分子

8 讨论

结论

本研究创新型的自我评价

参考文献

综述 IL-33生物学活性及其应用

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历