人工栽培蛹虫草（Cordyceps militaris）性状变异的遗传学分析

摘要

蛹虫草Cordyceps militaris(L.)Link为虫草属食、药用真菌,它可以代替冬虫夏草入药.而在人工驯化栽培过程中,蛹虫草菌种的退化现象比较严重,目前对虫草属真菌的研究只限于菌种的鉴定、营养成分分析、药用价值研究及人工栽培等.用常规选育方法虽然能减少一定的损失,但不能从根本上解决菌种退化这一长期困扰企业生产的问题.针对菌种退化问题,主要是利用有性循环、原生质体融合和遗传工程等途径进行菌株改良,应用分子生物学手段只是研究种内、种间的系统关系等,而关于菌种退化遗传机理的研究尚未见报道.菌种退化是菌类栽培过程中普遍存在的,也是生产当中迫切希望得到解决的问题.本实验中,运用RFLP和RAPD两种分子标记技术及同工酶分析技术对正常菌株和其退化菌株进行了DNA和蛋白质水平的分析,以期获得表型性状的变化所涉及的DNA和蛋白质水平的标记.PCR-RFLP实验,采用真菌通用引物ITS1和ITS4,扩增出5.8S和其两端的两个转录间隔区(ITS),选用5种识别四个碱基的内切酶(HaeⅢ、AfaⅠ、Tag Ⅰ、Alu Ⅰ和Xsp Ⅰ)进行酶切,其中只有Xsp Ⅰ酶切结果在两个菌种中存在差异,进一步测序表明,整个片段全长534bp,共有13个位点发生碱基突变,且都为c转换为t.野生驯化菌株的测序结果与Genbank中检索到的序列顺序一致.RAPD实验,选用Operon公司的4组(G组、H组、L组、M组)计80个随机引物进行PCR扩增,共筛选出9个对所有供试个体均存在明显差异的引物.由这9种引物计算所得的菌株间的相似系数为:OPG9:28.6％;OPH4:44.4％;OPH12:33.3％;OPL1:50％;OPL9:40％;OPM2:33.3％;OPM17:57.1％:OPM19:72.7％;OPG13为0,其中最大值为72.7％,平均值为39.9％,结果表明了退化菌株较野生驯化菌株在DNA水平上发生了频率较高的突变,这些突变可能与菌种退化的基因相关联.采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对菌丝体阶段的蛹虫草Cordyceps militaris(L.)Link及其退化菌株进行了同工酶分析.共检测了酯酶(EST)、过氧化物酶(PER)、超氧化物歧化酶(SOD)、苹果酸酶(ME)、苹果酸脱氢酶(MDH)、谷氨酸脱氢酶(GDH)、乙醇脱氢酶(ADH)、细胞色素氧化酶共计8种同工酶,其中酯酶、超氧化物歧化酶、苹果酸酶、苹果酸脱氢酶在正常菌株和退化菌株中出现了明显的差异.而其余四种酶在正常菌株和退化菌株中酶谱一致.本研究不仅可以作为菌株退化早期鉴别的手段之一,而且为进一步研究菌种退化遗传机理提供了蛋白质水平上的一些理论依据.

目录

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前言

材料和方法

1.1实验材料

1.1.1菌株及其培养

1.1.2主要试剂

1.1.3酶和其它试剂

1.1.4仪器

1.2方法

1.2.1 RFLP分析

1.2.2RAPD分析

1.2.3同工酶分析

结果与分析

2.1RFLP分析

2.1.1基因组DNA

2.1.2引物ITS1、ITS4的PCR扩增结果

2.1.3限制性内切酶结果

2.1.4核苷酸序列测定

2.2RAPD分析

2.2.1基因组DNA

2.2.2筛选引物的结果

2.2.3RAPD的扩增结果

2.3同工酶分析

2.3.1各种同工酶的染色结果

讨论

3.1 RFLP分析目的片段的选择

3.2RFLP和RAPD分析

3.3同工酶作为遗传标记的研究

3.4菌种退化的防治与菌株改良

综述

4.1虫草属的主要药用真菌

4.2虫草属真菌的营养成份和药用价值

4.3虫草属真菌的人工驯化与栽培

4.4虫草属真菌的发展方向

参考文献

致谢