顺序注射荧光法测定碱性磷酸酶及其应用

摘要

碱性磷酸酶(ALP)是一种广泛存在于人体、动物、植物及微生物体内的膜结合蛋白，在碱性条件下具有催化活性。碱性磷酸酶活性检测在食品检验以及临床诊断方面具有十分重要的作用。高度自动化、程序化的顺序注射技术不仅能够精确控制反应条件，而且还能有效降低试剂试样的消耗，在与酶促反应相关研究中逐渐引起关注。本实验是以碱性磷酸酶为研究对象，建立以顺序注射为基础的酶法分析系统，进而应用于实际样品的即时评价。主要工作有以下两方面：
　　 1.以4-甲基伞形酮磷酸酯(4-MUP)为底物，建立了碱性磷酸酶的顺序注射荧光分析系统。在系统内进行了试剂试样浓度、取样体积、反应时间、流速等影响酶促反应的因素的优化，并对检测碱性磷酸酶的性能进行了评价。结果表明，碱性磷酸酶在50～1000mU/L的活性范围内有较好的线性范围，其回归方程为△F=143.4CALP+6.859(r2=0.9988)；根据IUPAC推荐的方法计算出检出限为14 mU/L；对200 mU/L ALP标液进行11次测定得到了方法相对标准偏差RSD为2.3％；试剂消耗量低，试样与底物消耗的体积分别为20μL、40μL；操作简单、分析速度快以及自动化程度高，分析频率为15 h-1。
　　 2.牛乳制品中含有一定量的碱性磷酸酶，其热稳定性比病原菌要高，因此，碱性磷酸酶活性可以作为巴氏消毒水平的评价指标。本实验将上述建立的顺序注射荧光法应用于鲜奶和巴氏牛奶中碱性磷酸酶活性检测并进行了加标回收实验，结果表明该方法准确度较高，能够评价牛奶巴氏灭菌水平。与ISO标准方法和国标法相比分析速度快，自动化程度高，试剂消耗少，测定成本低，适用于大批量样品的分析。

目录

文摘

英文文摘

1 绪论

1.1 碱性磷酸酶

1.1.1 碱性磷酸酶简介

1.1.2 碱性磷酸酶的检测意义

1.1.3 碱性磷酸酶的测量方法

1.2 顺序注射分析技术

1.2.1 顺序注射分析技术简介

1.2.2 顺序注射结合酶法分析

1.2.3 顺序注射测定均相酶

1.3 本论文选题思路及研究目标

2 顺序注射荧光法测定ALP

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 实验仪器与试剂

2.2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 最佳条件

2.3.2 分析性能

2.4 结论

3 顺序注射荧光法测定牛奶中ALP

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 仪器与试剂

3.2.2 奶样处理

3.2.3 牛奶ALP测定

3.2.4 回收率实验

3.2.5 对照实验

33 结果与讨论

3.3.1 奶样处理

3.3.2 样品测定和加标回收率结果

3.3.3 对照实验

3.4 结论

结 论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢