人工合成基因重组肽rLj-RGD4对小鼠黑色素瘤B16细胞的抑制作用

摘要

rLj-RGD4是一个人工合成基因重组肽。本课题组以前期研究的rLj-RGD3为原型进行了缺失突变体的基因设计，并且通过在表达序列增加终止密码子，以获得无纯化标签的rLj-RGD4肽表达。rLj-RGD4的原型rLj-RGD3是一个分子量为14.5 kDa的RGD毒素蛋白，其来源于海洋生物-七鳃鳗。rLj-RGD3含有3个RGD序列，具有强效抗肿瘤功能。由于rLj-RGD3分子量较大，在未来的生物制药中存在潜在的免疫原性风险，故本课题对其进行了蛋白缩短改造，设计出Lj-RGD4基因。本课题人工合成的Lj-RGD4基因构建于pET23b质粒载体，对获得的带有阳性重组质粒(pET23b-RGD4)的表达菌BL21进行了终浓度为1 mM的IPTG重组表达。经对表达时间和表达温度的条件摸索，最后确认rLj-RGD4在30℃条件下诱导12 h可溶性表达量最高。rLj-RGD4为自身带有5个组氨酸残基，故对无纯化标签的rLj-RGD4仍可采用镍柱进行亲和层析纯化。rLj-RGD4肽分子量为6.27 kDa，含有4个RGD模体。纯化蛋白经N-端测序，结果证实表达序列和理论推导序列一致。
　　为了研究无纯化标签的rLj-RGD4肽对肿瘤细胞的生物学功能，本课题采用小鼠黑色素瘤细胞B16作为研究模型进行实验。本课题针对肿瘤的增长和转移的几个关键性步骤，对rLj-RGD4肽的功能进行了测定。细胞增殖实验(MTT法)表明，rLj-RGD4肽能够剂量依赖性地抑制bFGF诱导的小鼠B16细胞的增殖，其作用的半抑制浓度(half maximal inhibitoryconcentration， IC50)为9.6μM。细胞黏附实验结果表明，rLj-RGD4以剂量依赖方式抑制B16细胞对纤粘连蛋白(fibronectin，FN)的黏附。Transwell法和细胞划痕实验结果证实，rLj-RGD4对碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)诱导的B16细胞迁移具有抑制作用，且呈剂量依赖方式。利用Transwell和人工基质膜Matrigel模仿体内细胞外基质环境进行的细胞浸润实验结果显示，rLj-RGD4对碱性成纤维生长因子诱导的B16细胞浸润具有抑制作用且呈剂量依赖方式:小剂量4.8μM的rLj-RGD4对B16细胞浸润的抑制率为31.7％，中剂量9.6μM的Lj-RGD4对B16细胞迁移的抑制率为72.3％，而高剂量14.4μM的Lj-RGD4对B16细胞迁移的抑制率达到100％。接下来，本课题对rLj-RGD4肽能否引起B16细胞发生凋亡进行了测定。采用Hochest33258染色和TUNEL-FITC染色结果显示，rLj-RGD4能显著呈剂量依赖方式诱导B16细胞发生凋亡，这表明了rLj-RGD4抑制B16细胞增殖的基础是凋亡而不是坏死;利用鬼笔环肽-FITC染色研究了rLj-RGD4对B16细胞骨架的影响。细胞骨架实验结果表明，rLj-RGD4蛋白能以剂量依赖方式破坏细胞骨架并抑制细胞伪足的形成。通过Western blot法进一步研究rLj-RGD4作用于B16黑色素瘤细胞的机制，结果表明其能使Caspase-3酶原表达并裂解成17 kDa亚单位的水平增加、使B16细胞的抗凋亡基因BcL-2表达下调。
　　综上所述，rLj-RGD4能够抑制肿瘤增长与转移的关键性步骤包括增殖、黏附、迁移、浸润及细胞伪足的形成，并且能够诱导B16细胞发生凋亡。由于其rLj-RGD4是分子量只有6.27kDa的小肽，其更加具有抗肿瘤药物的应用前景。未来随着对rLj-RGD4研究的进一步深入，有望为我国抗肿瘤药物研发提供一类抗肿瘤候选新药。

目录

声明

摘要

引言

1 绪论 动物毒素来源及人工合成RGD肽的研究进展

1．1 动物毒素RGD肽

1．1．1 动物毒素RGD肽的来源

1．1．2 动物毒素来源RGD肽的结构特征及其所处微环境

1．2 人工合成的RGD肽

1．3 RGD的功能

1．3．1 RGD与αⅡbβ3参与的血小板聚集和血栓形成

1．3．2 RGD与抗血管新生

1．3．3 RGD肽与肿瘤转移

1．4 小结

2 去纯化标签的Lj-RGD4的分子克隆、诱导表达及纯化工艺

2．1 材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 Lj-RGD4基因的来源

2．2．2 去纯化His标签的Lj-RGD4基因的分子克隆

2．2．3 重组质粒转化入E．coli BL21表达菌

2．2．4 重组rLj-RGD4(tag-)的诱导表达及纯化

2．2．5 纯化蛋白的Tricine-SDS PAGE电泳

2．2．6 蛋白质生物信息学分析

2．2．7 rLj-RGD4蛋白的N-端测序

2．2．8 考马斯亮蓝(G-250)法测定rLj-RGD4蛋白浓度

2．3 结果

2．3．1 rLj-RGD4基因的设计思路及生物信息学分析

2．3．2 rLj-RGD4基因的人工合成与克隆

2．3．3 rLj-RGD4(tag-)蛋白的诱导表达与纯化

2．3．4 rLj-RGD4蛋白N-端测序结果

2．3．5 绘制蛋白标准曲线并测量所得蛋白浓度

2．4 讨论

2．5 结论

3 重组突变体小肽rLj-RGD4对小鼠黑色素瘤B16细胞生物活性及部分机制的研究

3．1 材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要仪器

3．2 方法

3．2．1 MTT法检测rLj-RGD4蛋白对B16细胞增殖的影响

3．2．2 rLj-RGD4蛋白对B16细胞黏附的影响

3．2．3 划痕实验检测rLj-RGD4蛋白对B16细胞迁移的影响

3．2．4 Tranwell法检测rLj-RGD4蛋白对B16细胞迁移的影响

3．2．5 Tranwell法检测rLj-RGD4蛋白对B16细胞浸润的影响

3．2．6 Hoechst 33258检测rLj-RGD4蛋白对B16细胞凋亡的影响

3．2．7 TUNEL法检测rLj-RGD4蛋白对B16细胞凋亡的影响

3．2．8 鬼笔环肽检测rLj-RGD4蛋白对B16细胞骨架的影响

3．2．9 Western Blot检测rLj-RGD4蛋白对凋亡相关蛋白caspase-3和Bcl-2表达的影响

3．2．10 结果统计

3．3 结果

3．3．1 rLj-RGD4蛋白对bFGF诱导的B16细胞增殖的抑制作用

3．3．2 rLj-RGD4蛋白对B16细胞黏附于细胞外基质蛋白的抑制作用

3．3．3 rLj-RGD4蛋白对bFGF诱导的B16细胞迁移的抑制作用

3．3．4 rLj-RGD4蛋白对bFGF诱导下B16细胞浸润的抑制作用

3．3．5 rLj-RGD4蛋白对bFGF诱导下的B16细胞凋亡的作用

3．3．6 rLj-RGD4蛋白对B16细胞骨架的破坏作用

3．3．7 rLj-RGD4蛋白对B16细胞凋亡通路中关键分子Caspase-3和Bcl-2的影响

3．4 讨论

3．5 结论

本论文的创新点

展望及今后需要研究的问题

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢