Rap1GAP二聚体的形成及对其GAP催化活性的影响

摘要

为了研究Rap1GAP的作用机制及Rap1GAP在信号转导中的作用,我们应用酵母双杂交体系(yeast two hybrid system)寻找潜在的与Rap1GAP相作用的蛋白质.由于对C.elegans的研究较详细,对其每个基因的功能及DNA序列已经清楚,故我们首先应用C.elegans来源的RapGAP作为饵蛋白探查C.elegans的cDNA文库.如果发现编码与RapGAP相互作用的蛋白质的基因与人具有同源性,则进一步研究人的相关基因.在酵母双杂交系统中,将pPC97-RapGAP与pPC86-cDNA文库共转化入酵母菌Y190细胞,经过-LTH筛选后,有63个菌落拟为阳性菌落.进一步做Lac Z鉴定,19个菌落为阳性,其中7个菌落为强阳性.将酵母菌中提取的质粒经PCR扩增,有12个菌落出现阳性结果.将PCR扩增阳性及/或Lac Z强阳性质粒电转化入DH5α细菌,提取质粒后酶切、测序.发现有6个来源于C.elegans cDNA文库的DNA片段编码的蛋白可以与RapGAP相互作用,其中两个为RapGAP.

目录

前言

第一部分通过Yeast two hybrid系统筛选与RapGAP相互作用的蛋白

第二部分人Rap1GAP在哺乳动物细胞中形成二聚体的确定

一.简介

二.实验方法与步骤

三.结果

四.结论

第三部分与二聚体形成有关的结构域的确定

第四部分与二聚体形成有关的保守氨基酸的确定

第五部分全长Rap1GAP、野生型△NC及突变体蛋白在BL21细菌中的诱导表达及纯化

第六部分二聚体对Rap1GAP催化活性的影响

讨论

结论

本论文的创新之处

进一步需要研究的问题

致谢

参考文献

综述小分子G蛋白Rap1活性的调节及其在信号转志中的作用

GEFs对Rap1的激活调节

Rap1失活的调节

Rap1的效应子(effectors)

参考文献

攻读博士期间发表的论文

个人简历