乳酸杆菌发酵滤液中核酸抗肿瘤效应及对荷瘤鼠免疫功能的影响

摘要

目的：乳酸杆菌是人体正常菌群的重要组成成员之一，大量的研究和实践证明其具有显著的提高机体免疫力，保持宿主健康的功能。通过流行病学调查发现，长期食用经乳酸杆菌发酵的酸奶制品可降低乳腺癌、结直肠癌、胃癌及膀胱癌的发生率，但其抗肿瘤分子机制还不十分清楚。我们发现乳酸杆菌DM9811对数生长期发酵滤液中存在大量的核酸组分。已有报道乳酸杆菌基因组AT核苷酸可以通过增强TH1型免疫反应来上调机体抗肿瘤免疫水平。乳酸杆菌发酵滤液中核酸组分的性质、来源、是否在抗肿瘤效应中起到重要作用值得进行研究。本实验通过对乳酸杆菌DM9811发酵滤液中核酸组分进行定量、定性分析，观察其在体外对肿瘤细胞生长的影响及对荷瘤鼠免疫功能的影响，研究该核酸组分是否具有抗肿瘤效应，从而探讨其可能的分子作用机制及该核酸组分成为新一代抗肿瘤活性物质的可能性。 方法：1.乳酸杆菌DM9811发酵滤液中核酸的提取、定性、定量。将菌液用0.45um滤器过滤，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀后溶于去RNA酶水；260nm比色，观察其OD值与细菌菌数的关系；琼脂糖电泳分析滤液中核酸和乳酸杆菌胞内核酸，对RNA酶消化前后电泳条带进行对比。2.体外观察滤液中核酸对结肠癌HT-29细胞系的抑制效应。调结肠癌HT-29细胞浓度为1×106，MTT法观察抽提的核酸组分浓度分别为10ug/ml、50ug/ml、100u/gml时对结肠癌HT-29细胞系生长的影响。3.体内观察滤液中核酸对荷瘤鼠免疫功能的影响。纯系615小鼠分为预防组、治疗组和阴性对照组，阴性对照组腹腔注射0.1ml生理盐水；预防组隔日注射核酸10ug/0.1ml·只-1，共五次，于末次注射24小时后右前腋下接种小鼠腹水型肝癌细胞株106/0.1ml·只-1；治疗组荷瘤48小时后开始隔日注射核酸10ug/0.1ml·只-1，五次后处死小鼠，观察不同组别小鼠生存期、瘤重体重比、NK细胞活性、T淋巴细胞亚群指标的差异。 结果：1.乳酸杆菌DM9811发酵滤液中核酸组分为RNA，其片段大小为100bp-200bp。对数生长期期间滤液中RNA含量随时间的延长而升高，与细菌菌数呈正相关关系，相关系数为0.990(P＜0.05)。2.体外抑瘤实验：在细胞浓度为1×106时，RNA浓度100ug/ml能够明显抑制结肠癌HT-29细胞系的生长，抑制率为29.22±4.32﹪；50ug/ml、10ug/ml对结肠癌HT-29细胞系的生长没有显著的抑制作用。3.体内实验：预防组荷瘤鼠除CD8+T细胞比例之外各项指标与阴性对照组相比都有显著性差异(P＜0.05)，其中NK细胞杀伤活性(58.97±3.62)、CD4+T细胞比例(27.77±5.40)和生存期(15.1±4.48)均高于阴性对照组(43.87±3.92)、(19.68±3.00)、(10.2±3.08)，瘤重体重比(0.029±0.017)低于阴性对照组(0.066±0.024)；治疗组除生存期以外的其他指标与对照组相比无显著性差异，生存期(11.8±3.12)与阴性对照组(10.2±3.08)相比有显著性差异(P＜0.05)，治疗组生存期长于阴性对照组。 结论：1.乳酸杆菌DM9811发酵滤液中存在100-200bp之间的RNA片段，RNA含量与细菌菌数的对数值呈正相关关系，其来源很可能是细菌分泌的。2.乳酸杆菌DM9811发酵滤液中RNA组分浓度为100ug/ml时对结肠癌HT-29细胞系生长有抑制作用。3.预先腹腔注射RNA组分可以上调荷瘤鼠的细胞免疫水平，延长荷瘤鼠的生存期；荷瘤后给予RNA组分进行治疗也能够延长荷瘤鼠的生存期。

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讨论

结论

致谢

参考文献

附图：

综述益生菌治疗炎症性肠病的研究进展