利用产生3－HPA的乳酸杆菌与中链三酸甘油酯油结合改进哺乳动物免疫功能的方法

摘要

本发明涉及一种利用能够产生所选择的3－HPA的乳酸杆菌与中链三酸甘油酯(MCT)油相结合来改进哺乳动物免疫功能的方法。

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及在用于哺乳动物的产品中采用MCT(中链三酸甘油酯)油与乳酸杆菌的特定菌株相结合以实现提高免疫的效果。

相关技术的描述

在营养学中，通常被称为脂肪或油脂的物质是被化学家和营养学家们分类为脂质的几种物质中的一种。脂肪的特征是不溶于水并且只溶于特定的溶剂例如乙醇中。脂肪与糖类的组成相类似但是每克脂肪提供了更高的能量。它们包含比糖类多2至2.5倍的能量。不幸的是，脂肪在新陈代谢中利用氧气很不经济并且结果是很难燃烧。身体需要脂肪用于各种过程，例如它们被用于构建细胞壁和它们为脂溶性维生素(维生素A、D、E和K)提供传输机制。

有三种类型的脂肪：三酸甘油酯、胆固醇和磷脂。在食物中发现的脂肪和油脂主要是三酸甘油酯。三酸甘油酯由甘油和三个脂肪酸链组成，甘油是一种醇类三酸甘油酯构成了我们消耗和储存在身体中脂肪的大部分。它们被分成三个不同的组：饱和的、单不饱和的、和多不饱和的。脂肪的分类与它们的化学组成相联系。饱和的脂肪酸具有接近的化学结构，它们的碳原子被氢原子“饱和”，使得其它化合物不可能与它们结合。单不饱和脂肪酸具有一个单一的双键和两个自由碳原子，氢原子的其它化学键可以与其发生反应。最后，多不饱和脂肪酸具有两个或更多双键并且具有多个可以进行结合的自由碳原子。这些双键使得不饱和脂肪酸比几乎惰性的饱和脂肪酸更具生物活性。

作为三酸甘油酯成分的脂肪酸是由不同长度的碳、氧和氢原子链组成的。碳链的长度导致这些链被分成短链、中链和长链三酸甘油酯。中链三酸甘油酯(MCT)具有独特的性质，其能使它们比其它形式的脂肪酸更加具有生物学上可利用性(Osbom H.T.et al，ComprehensiveReviews in Food Science and Food Safety，VoI 1，2002，page 93-103)。MCTs绕过了脂肪获取的常用路线，该路线被身体用来获取可用的能量。不像其它脂肪，要求身体在使用之前先储存它们，MCTs需要有限的加工并且在身体的能源系统中能快速获得而使用。中链三酸甘油酯的另一个明显特征是不管消耗了多少身体脂肪也不能将它们储存为身体脂肪。

MCT油是天然发生的，并且最丰富的来源是椰子油。绝大多数MCT油是从椰子油中精炼的。MCT油是一种清亮的、无味的、低黏度的液体。MCT油引起了人们的兴趣是因为当它在体内新陈代谢时，它的表现更像一种糖类而不是脂肪。身体的优先燃料是糖类，身体在使用其它燃料之前会先用完它的糖类储存。糖类很快起作用，运动员服用葡萄糖片以提供能量，当我们饮酒时身体很快发热，通常糖类在吃下去后几个小时之内就被利用，这就是为什么我们这样频繁的食用它。相反，脂肪的基本角色是储存能量，动物堆积脂肪已准备过冬。长链脂肪(即，常见的种类)通过消化系统转变成被称为乳糜微粒的化学品，而他们随后在进入循环系统之前通过淋巴系统被运输到身体各处。这是一个相对慢的过程，因此脂肪的代谢要比糖类慢得多。不像其它脂肪，MCT油不进入淋巴系统；相反，它被直接运送到肝脏并在那里被代谢，因此很快释放能量，就像一种糖类，并且在此过程中产生很多酮类。MCT常用于各种营养品中，包括医用营养品，例如非肠道或肠道营养品。

已经报道MCTs具有更多的直接健康效果。例如Tufano M.A.等人在＂Survival to lipopolysaccharide，cytokine release and phagocytefunctions in mice treated with different total parenteral nutritionregimens＂.(Immunopharmacol Immunotoxicol.1995 Aug；17(3)：493-509)中报道了带有长-(LCT)和中链三酸甘油酯(MCT)的全胃肠道外营养(TPN)对宿主抵抗力的效果。在经受了脂多糖(LPS)刺激，大肠杆菌(Escherichia coli)的血液清除之后，研究了肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)在体内和体外的产量。在BALB/c小鼠中，与对照相比LCTs降低了25％的死亡率。带有LCT和MCT混合物的TPN实现降低死亡率50％。

临床仔细控制三酸甘油酯注射的浓度，特别是MCT的浓度，有可能提供抗肿瘤的效果并且维持正常的免疫系统(Kimoto Y.et al.；Antitumor effect of medium-chain triglyceride and its influence on theself-defense system of the body；Cancer Detect Prev.1998；22(3)：219-24)。MCT油本身也作为营养配方中的一部分而被介绍，例如在欧洲专利EP0756827和美国专利US6589576中，但是没有与任何乳酸杆菌结合。而且，欧洲专利EP1344458A1公开了一种保护益生菌有机体例如乳酸杆菌的方法，将它们制成小球，优选地最小体积为0.02cm³并且随后可以用各种载体包被，包括MCT油。该工作与本发明的核心不相同，即本发明涉及在一种液体产品中将产生所选择的3-HPA(β-羟基-丙醛)的乳酸杆菌菌株与MCT油相结合以提高免疫能力。

根据普遍接受的定义，益生菌是一种活的微生物饲料补充剂，其通过改善宿主动物肠内的微生物平衡而给宿主动物带来有益效果。虽然最初指的是农场动物的动物饲料补充剂，该定义也很容易接受为适用于人类的情况。人类消耗的主要益生菌是包含肠道乳酸杆菌和双歧杆菌菌种的乳制品形式的食品。在定义中暗示益生菌的消耗影响肠内的微生物菌落的组成。有人提出益生菌对肠内生态系统的这种影响，有益于摄取者。通过益生菌的作用而改变肠内微生物菌群所带来的多种益处已有文献指出的包括：提高对传感性疾病的抵抗力，尤其是肠的，减少腹泻的持续时间，降低血压，减少血液中胆固醇的浓度，减少过敏，刺激外周血白细胞的吞噬作用，调节细胞因子基因表达，辅助作用，消退肿瘤，以及减少致癌物或辅致癌物的产生。

很多种类的乳酸杆菌菌株，包括路氏乳酸杆菌已经被用于配制益生菌制剂。路氏乳酸杆菌是一种在动物胃肠道中天然产生的居住者，并且通常发现于健康动物，包括人的肠内。已知它具有抗微生物活性。参见美国专利US 5,439,678、5,458,875、5,534,253、5,837,238、和5,849,289。当路氏乳酸杆菌细胞在存在甘油厌氧条件下生长时，它们产生被称为β-羟基-丙醛(3-HPA)的抗微生物物质。

3-HPA是一种代谢中间产物，通过几种乳酸杆菌从细胞分泌。那些已知输出3-HPA的细菌种类包括路氏乳酸杆菌、棒状乳杆菌、丘状乳杆菌、希氏乳杆菌等(Claisse O等人J Food Prot.2001 Jun；64(6)：833-7)(Sauvageot N等人Int J Food Microbiol.2000 Apr 10；55(1-3)：167-70)。长久以来人们就知道3-HPA具有抗微生物特性，这部分解释了生产菌株杀死病原菌的能力。乳酸杆菌包括路氏乳酸杆菌和棒状乳杆菌，也已经显示出会对它们的宿主有机体的免疫系统产生影响。参见，例如Wagner RD等人的“Biotherapeutic effects of probioticbacteria on candidiasis in immunodeficient mice”(Infect Immune 1997Oct 65：4165-72)；然而，在菌株之间存在效果的差异并且需要提高效果的方法，例如在WO 2004/034808中提供的选择募集CD4+细胞并且结合毒素的菌株的方法。乳酸杆菌刺激或修饰宿主免疫细胞活性的确切机制仍然不太清楚。许多研究显示释放到生长基质中的来自所选择的乳酸杆菌中的特异性物质负责调节宿主细胞的免疫应答。这些物质一般被认为是蛋白质，多肽和核酸。例如，参见Pena等人的CellMicrobiol.2003 Apr；5(4)：277-85。

本发明在此提供了一种用于提高特定乳酸杆菌在一些动物包括人类中的免疫调节作用的新方法，即通过将产生所选择的3-HPA的乳酸杆菌与MCT油相结合。这种组合的效果除了包括以前已知的那些乳酸杆菌的免疫调节以外还包括那些乳酸杆菌的抗微生物作用。它带来的效果是产生3-HPA并且通过这种物质而直接作用于淋巴细胞的增殖。3-HPA或者其前体甘油、或者其代谢产物、1，3-丙二醇和3-羟基-丙酸，此前并没有被作为哺乳动物免疫系统的潜在调节剂而公开。

虽然几种乳酸杆菌可能抗微生物活性的作用是已知的，并且其特定的免疫调节作用也是已知的，但是以前并不知道通过将产生3-HPA的菌株与MCT油相结合能明显提高免疫调节作用。

因此本发明的一个目的是提供在适当条件下已知产生3-HPA的乳酸杆菌的菌株并且将它们与MCT油结合从而提高免疫调节。本发明的另一个目的是提供包含所述菌株和MCT油的产品给动物，包括人类施用。

其它的目的和优点将通过以下的说明和权利要求而更加清楚。

发明概述

本发明这里是一种利用产生所选择的3-HPA的乳酸杆菌与MCT油结合而提高哺乳动物免疫功能的方法。这种组合的效果不仅仅是以前已知的那些乳酸杆菌的免疫调节和抗微生物作用。它带来的效果是3-HPA的产生并且通过这种物质而直接作用于淋巴细胞的增殖。其它的目的和优点将通过以下的说明和权利要求而更加清楚。

附图说明

图1显示了吞噬细胞检测结果：A，细胞对照；B1，路氏乳酸杆菌溶菌产物(800μg/ml)；B2，路氏乳酸杆菌溶菌产物(400μg/ml)；  B3，路氏乳酸杆菌溶菌产物(200μg/ml)；B4，路氏乳酸杆菌溶菌产物(100μg/ml)；B5，路氏乳酸杆菌溶菌产物(50μg/ml)；C1，单核细胞增生李斯特菌溶菌产物(800μg/ml)；C2，单核细胞增生李斯特菌溶菌产物(400μg/ml)；C3，单核细胞增生李斯特菌溶菌产物(200μg/ml)；C4，单核细胞增生李斯特菌溶菌产物(100μg/ml)；D，路氏乳酸杆菌上清液(MRS)；E，路氏乳酸杆菌上清液(甘油溶液)；F，路氏乳酸杆菌+单核细胞增生李斯特菌溶菌产物。

图2显示了淋巴细胞增殖检测结果：B，ConA(6.25μg/ml)；C，PWM(5μg/ml)；D，PHA(6.25μg/ml)；E5，LPS(2.5μg/ml)；F1，路氏乳酸杆菌溶菌产物(400μg/ml)；F2，路氏乳酸杆菌溶菌产物(200μg/ml)；F3，路氏乳酸杆菌溶菌产物(100μg/ml)；F4，路氏乳酸杆菌(50μg/ml)；G1，路氏乳酸杆菌上清液(MRS 100μl)；G2，路氏乳酸杆菌上清液(MRS 50μl)；H1，路氏乳酸杆菌上清液(甘油溶液100μl)；H2，路氏乳酸杆菌上清液(甘油溶液50μl)。

图3显示了在RL(路氏乳酸杆菌)和PC(阳性对照)治疗中施用单核细胞增生李斯特菌(6d)3天后的细菌数。

图4a-4g显示的是接种单核细胞增生李斯特菌之后3天(6d)和2个星期(17d)主要免疫细胞的分析结果。具体地，图4a显示(beta)TCR+CD3-T细胞，图4b显示CD4+CD25+T细胞，图4c显示CD8+T细胞，图4d显示CD4/CD8比率，图4e显示(gamma，delta)TCR+CD25+T细胞，图4f显示NK+CD28+细胞，以及图4g显示NK+细胞。

图5是本发明产品制备工艺一个实施例的流程图。

发明详述和优选实施例

令人惊奇地发现，乳酸杆菌在甘油条件下培育所产生和输出的物质或代谢物能够刺激免疫系统的重要细胞成分以及全面提高宿主免疫系统并且能够抗感染。饲喂物质(例如油、脂肪和脂质)并且期望通过在胃肠道代谢产生甘油的条件与从甘油中产生3-HPA的乳酸杆菌相结合，刺激宿主的免疫系统。MCT油是本发明这里最佳的添加剂，如下所述。因此，以这样的方式将乳酸杆菌输送给宿主是有优势的。

本发明的一个优选实施例是一种产品，包含MCT油和产生3-HPA的乳酸杆菌，其被制备和用于患有脂肪代谢发育不良的人口服或者插管饲喂到胃肠道中，例如大多数正常的婴儿和幼儿，但是也包括患有脂肪代谢障碍的成人。原因是本发明的MCT-油的脂肪代谢，例如，通常胃肠道中不产生甘油而是产生单酰基甘油(仍然带有一个脂肪酸的甘油)。这些单酰基甘油通过消化道的壁被吸收并且在肝和循环系统中被加工成新的脂质；然而，例如，人乳中分泌的胆汁盐刺激的脂酶被发现缺乏位置特异性，即，它水解乳化的三酰基甘油成甘油和脂肪酸。它还水解微粒化的sn-2单酰基甘油(＂sn＂指的是脂肪酸在酰基甘油的甘油骨架上的位置，例如，sn-2位置是脂肪酸在甘油骨架的中间位置)。这与胰脂酶相反，该酶显著优先水解sn-1和sn-3酯键。当两种酶一起作用时，比如在母乳喂养的婴儿肠胃中，通过胰脂酶所形成的sn-2单酰基甘油成为了胆汁盐刺激脂酶的极好的底物。(Pediatric Research，VoI 16，882-885，Digestion of human milk lipids：physiologic significance of sn-2 monoacylglycerol hydrolysis by bilesalt-stimulated lipase，O.Hemell and L.Blackberg)。这样，三酰基甘油水解的终产物就成为甘油和脂肪酸而不是sn-2单酰基甘油和脂肪酸。胆汁盐刺激的脂酶还催化脂肪酸掺入到酰基甘油中，但其程度远远小于胰脂酶。胆汁盐刺激的脂酶的这两种作用一起促进了管腔内的脂解作用整个过程。在新生婴儿中，十二指肠内的胆汁盐浓度很低，甘油和脂肪酸也应该比单酰基甘油和脂肪酸更加容易吸收。因此，作为胰脂酶的补充，胆汁盐刺激脂酶可以确保婴儿和其它脂肪消化和吸收机制不成熟的人充分利用例如牛奶脂质。结果，例如，婴儿具有的从他们母乳(或者配方奶)中获取脂质的不同系统，因为他们的脂肪代谢不成熟，因此，作为哺乳婴儿补充剂的产生3-HPA的乳酸杆菌在这样的情况下具有相当丰富的甘油来源共同作用，但是为了确保获得可以代谢为产生3-HPA的分泌物的脂肪并且提高本发明的免疫功能，本发明的计划是一种脂肪来源，例如MCT油应该和产生3-HPA的乳酸杆菌一起被分送。这有助于提高例如婴儿的免疫系统的作用。

在以上优选的实施例中，本发明的产品被分送到胃肠道中以提高接受者体内整个或局部的免疫系统。在胃肠道中产生的3-HPA可以影响整个免疫系统的原因是胃肠道中丰富的免疫功能。这是通过，例如，细胞例如生长在粘膜和肠壁上的巨噬细胞和淋巴细胞。很多本领域的专家认为胃肠道是人身体中最大的免疫器官(＂Overview of gutflora and probiotics＂，Holzapfel，W.H.et.al.，International Journal ofFood Microbiology，May 1998)。

在本发明的另一个优选实施例中可以采用一种相似的产品，例如包含MCT-油和产生3-HPA的乳酸杆菌，但是局部施用用于增强免疫系统和抵抗皮肤疾病。通过皮肤上皮的分散和与皮下免疫细胞的相互作用能够提高对抗病原菌的免疫作用同时减少炎症反应和治疗，例如湿疹、痤疮和伤口。

MCT油是不常见的脂质，它们迅速裂解并且能快速发生甘油，这就是MCT被用于本发明中以提高的免疫效果的原因。根据本发明的益生菌、预防剂和药物制剂产品可以包含营养或药物使用可接受的任何添加剂和赋形剂。中链三酸甘油酯油是一种含油的中链三酸甘油酯，即甘油的中链脂肪酯。中链脂肪酸是本领域公知的并且包含6至12个碳原子，优选8至10个碳原子例如辛酸和癸酸。来自卡尔斯港的Akomed R是根据本发明可用的MCT油的实施例。它包含辛/癸三酸甘油酯。

从以下例子可以看到，用于本发明的MCT油在市场上可容易获得。可以采用不同的方法分离产生3-HPA的乳酸杆菌，例如RodriguesE.等人所描述(Letters in Applied Microbiology Volume 37 Issue 3 Page259-September 2003)。优选的种类之一是路氏乳酸杆菌并且一个优选菌株是路氏乳酸杆菌ATCC 55730。

本发明的特征通过参考以下例子将被更加清楚的理解，其不应该被解释成本发明的限制。

实施例1：巨噬细胞中提高的吞噬活性

概述

路氏乳酸杆菌上清液取自存在和不存在甘油(50mM)条件下生长的路氏乳酸杆菌ATCC 55730中。这些上清液被用于预处理腹巨噬细胞(取自6周龄的SPF B ALB/c小鼠)过夜孵育。巨噬细胞随后采用单核细胞增生李斯特菌接种以确定它们的吞噬细胞能力。孵育2小时后，确定在巨噬细胞中存活的单核细胞增生李斯特菌的数量。

对照在不存在路氏乳酸杆菌上清液的条件下孵育，显示出在这些条件下巨噬细胞中明显的单核细胞增生李斯特菌存活率。利用生长在不存在甘油条件下的路氏乳酸杆菌细胞的上清液预处理巨噬细胞，与对照孵育相比，不影响吞噬细胞吞噬作用(图1)。然而，令人惊奇的是，利用来自生长在存在甘油条件下的路氏乳酸杆菌细胞的上清液预处理巨噬细胞导致巨噬细胞有效杀死所有的单核细胞增生李斯特菌。因此，在存在甘油情况下生长的路氏乳酸杆菌能够刺激细胞的吞噬活性。单独存在甘油的培养基(对照)不具有这样的效果(对照＂H＂与其它对照相同)。

利用路氏乳酸杆菌或单核细胞增生李斯特菌的酶解物预处理巨噬细胞，可以以一种剂量依赖的方式诱导相似但是不太显著的巨噬细胞吞噬作用活性的刺激。在路氏乳酸杆菌中甘油-诱导的代谢导致更有效地刺激吞噬细胞活性，优于抗原暴露的诱导。

实验详述

研究方法

1.吞噬细胞检测和淋巴细胞增殖检测。淋巴细胞和腹巨噬细胞分离自特异的无病原菌BALB/c小鼠(6周龄)并且被用于检测宿主中的任何免疫再增强效果。吞噬作用利用腹巨噬细胞。

-腹巨噬细胞的分离。BALB/c小鼠拉颈处死，随后采用5ml的IMDM培养基(Iscove′s modified Dulbecco′s medium)浸渍并且按擦。回收浸渍的IMDM，并且采用酞酚蓝显示技术计数活的细胞并且以调节的终浓度1x10⁶/ml用于实验中。

-细菌溶菌产物的制备。路氏乳酸杆菌SD2112和单核细胞增生李斯特菌HPB3血清型4b分别在MRS+0.02M葡萄糖培养基和胰酶大豆培养基(TSB)中孵育24小时，并且在8,000rpm离心20分钟以收集细胞碎片。细胞碎片利用0.9％NaCl溶液清洗两次。随后在60℃加热3小时灭活，并且蛋白质的浓度通过双辛可宁酸(BSA)蛋白检测方法计算并且调节到5mg/ml。

-路氏乳酸杆菌上清液的制备。路氏乳酸杆菌在MRS+0.02M葡萄糖培养基中孵育24小时并且离心以获得MRS培养基上清液。上清液悬浮在0.05M甘油溶液中并且孵育6小时，随后回收甘油溶液上清液。回收的细胞碎片数量高达2g/30ml(湿重)。在调节pH至7.3之后所有回收的上清液被采用。

-吞噬作用检测。腹巨噬细胞被悬浮在IMDM+10％马血清中，4x10⁵个细胞每孔，并且利用各种浓度的路氏乳酸杆菌、单核细胞增生李斯特菌细胞溶菌产物和路氏乳酸杆菌上清液过夜孵育处理，浓度和条件如下：

表1、吞噬作用检测的处理条件

  编号           处理(μg/ml)  编号    处理  (μg/ml)  A  细胞对照  -  D1路氏乳酸杆菌上清液(MRS)    100  B1  路氏乳酸杆菌溶菌产物  800  D2路氏乳酸杆菌上清液(MRS)    50  B2  路氏乳酸杆菌溶菌产物  400  E1路氏乳酸杆菌上清液(甘油溶液)    100  B3  路氏乳酸杆菌溶菌产物  200  E2路氏乳酸杆菌上清液(甘油溶液)    50  B4  路氏乳酸杆菌溶菌产物  100  F1路氏乳酸杆菌+单核细胞增生李斯特菌溶菌产物    400+400  B5  路氏乳酸杆菌溶菌产物  50  F2路氏乳酸杆菌+单核细胞增生李斯特菌溶菌产物    200+200  C1  单核细胞增生李斯特菌  溶菌产物  800  F3单核细胞增生李斯特菌溶菌产物    100+100  C2  单核细胞增生李斯特菌  溶菌产物  400  GMRS对照    100  C3  单核细胞增生李斯特菌  溶菌产物  200  H甘油溶液对照    100  C4  单核细胞增生李斯特菌  溶菌产物  100  IIMDM对照    -

MRS对照和甘油溶液对照通过在培养基中调节PH而被采用，其没有用路氏乳酸杆菌孵育。

用上述条件处理的腹巨噬细胞被孵育在TBS中并且用4x10⁴单核细胞增生李斯特菌(HPB3血清型4b，庆大霉素敏感)接种并用0.9％NaCl溶液清洗。在37℃孵育2小时之后，清洗巨噬细胞并随后采用200μg/ml庆大霉素处理以杀死细胞外的细菌。细胞采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三次并采用0.5ml/孔的PBS+0.5％Triton X-100溶解以暴露细胞内的微生物。然后，细菌的数量通过连续稀释利用Palcam琼脂(Oxoid me，Ogdensburg，N.Y.，USA)和胰酶大豆琼脂(Oxoid Inc，Ogdensburg，N.Y.，USA)采用薄层方法进行计数。

实施例2：提高的淋巴细胞增殖

概述

从BALB/c小鼠脾和胸腺制备淋巴细胞，并孵育在存在和不存在甘油(50mM)情况下生长的路氏乳酸杆菌ATCC 55730的上清液中。选择路氏乳酸杆菌ATCC 55730是由于它是已知的3-HPA的良好生产者并因此符合本发明的选择要素。对照孵育采用单独的甘油，单独的培养基和已知的淋巴细胞增殖刺激剂。

已知的刺激剂(ConA，PWM，PHA abd LPS)引发显著的淋巴细胞增殖刺激。来自路氏乳酸杆菌的溶菌产物导致一个小的，剂量依赖的淋巴细胞增殖刺激，并且与来自生长在不存在甘油情况下的路氏乳酸杆菌上清液孵育没有导致淋巴细胞增殖的明显提高。令人惊奇的是，生长在存在甘油情况下的路氏乳酸杆菌的上清液导致淋巴细胞的增殖水平提高至明显高于所见到的已知刺激剂达到的水平(见图2)。

实验详述

淋巴细胞增殖检测

-分离脾和胸腺淋巴细胞。BALB/c小鼠拉颈处死，分离它们的胸腺，浸渍在Hanks′平衡盐溶液(HBSS)中并且逐步粉碎以获得单个细胞。单个细胞通过Histopaque-1083(Sigma)中的双层离心以获得淋巴细胞。这些细胞用IMDM清洗两次，并且活着的细胞通过苔酚蓝显示技术计数并且以调节的最终浓度1x10⁷/mL用于实验中。

-细菌溶菌产物的制备。如在吞噬作用检测中所述，制备路氏乳酸杆菌和单核细胞增生李斯特菌溶菌产物。

-路氏乳酸杆菌上清液的制备。如在吞噬作用检测中所述，制备路氏乳酸杆菌上清液。

-淋巴细胞增殖检测。采用将淋巴细胞悬浮在IMDM+10％马血清中4x106个细胞每孔进行淋巴细胞增殖检测。利用不同浓度的路氏乳酸杆菌，单核细胞增生李斯特菌细胞溶菌产物和路氏乳酸杆菌上清液和参照刺激剂处理淋巴细胞，浓度和条件如下：

表2.淋巴细胞增殖检测的处理条件

编号          处理(μg/ml)编号    处理(μg/ml)    A细胞对照    -  G1路氏乳酸杆菌上清液(MRS)    100    BConA    6.25  G2路氏乳酸杆菌上清液(MRS)    50    CPWM    5  H1路氏乳酸杆菌上清液(甘油溶液)    100    DPHA    6.25  H2路氏乳酸杆菌上清液(甘油溶液)    50    ELPS    2.5  1IMDM对照    -    F1路氏乳酸杆菌溶菌产物    400  J1MRS对照    100    F2路氏乳酸杆菌溶菌产物    200  J2MRS对照    50    F3路氏乳酸杆菌溶菌产物    100  K1甘油溶液对照    100    F4路氏乳酸杆菌溶菌产物    50  K2甘油溶液对照    50

在表2所报道的结果中，MRS对照和甘油溶液对照通过在没有与路氏乳酸杆菌孵育的培养基中调节pH而被采用，并采用如下符号：

ConA：伴刀豆球蛋白A，PWM：美洲商陆有丝分裂原，PHA：植物血球凝集素，LPS：来自鼠伤寒沙门氏菌的脂多糖。

根据每个条件，向包含淋巴细胞的孔中加入包括ConA的刺激剂，在阿尔玛蓝以10％浓度被加入前的3小时。加入每种刺激剂72小时之后，采用OD570nm-OD600nm的值确定淋巴细胞增殖水平。

淋巴细胞增殖结果描绘为刺激指数(SI)，它是(OD处理液-OD培养基对照)/OD细胞对照的比值，然而，在路氏乳酸杆菌上清液处理小组的情况中，是J和K处理液小组的值，而不是IMDM+10％马血清，被用作OD培养基对照值。

小鼠体内刺激和免疫细胞分布率的改变

特定的无菌BALB/c小鼠(6周龄)被分成4个小组。路氏乳酸杆菌和单核细胞增生李斯特菌被制备成5x10⁸/小鼠并且口腔施用。在施用单核细胞增生李斯特菌之前30分钟，施用0.25M的10％碳酸氢钠以提高单核细胞增生李斯特菌的存活率。

表3、鼠处理小组

    小组    处理    样本阴性对照(NC)在研究期间施用PBS    6d，17d，31dR在研究期间施用路氏乳酸杆菌    6d，17dRL研究期间在施用单核细胞增生李斯特菌的3d施用路氏乳酸杆菌    6d，17d阳性对照(PC)研究期间在施用单核细胞增生李斯特菌的3d施用PBS    6d，17d，31d

为了研究路氏乳酸杆菌抵抗单核细胞增生李斯特菌的保护作用，每组中分别有8只小鼠在施加单核细胞增生李斯特菌之后的3天(6d)和14天(17d)被处死，并取出血液，肝脏和脾。此外，为了研究路氏乳酸杆菌本身在免疫机制中的作用，NC小组和R小组中都分别有8只小鼠在31d被进一步检测。

1)计算在肝脏和脾中的单核细胞增生李斯特菌

称量来自每个小鼠组中的肝脏和脾并且用10ml的PBS(pH 7.0)在搅拌器中均质化。活着的细菌连续稀释采用Palcam琼脂计数。

2)采用流式细胞计检测免疫细胞

-从血液中分离白细胞。从2-3只动物抽血并且在Histopaque-1083中以1,500rpm双层离心30分钟，之后从淋巴细胞层中收集淋巴细胞。它们被磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三次并用RPMI-1640培养基悬浮，随后活着的细胞采用苔酚蓝显示技术计数并调节最终浓度为1x10⁷/ml而用于实验中。

-流式细胞检测采用白细胞表面单克隆抗体。分离的白细胞悬浮在含有20％山羊血清的第一清洗缓冲液中(PBS 450ml，ACD 50ml，20％NaN3 5ml，无γ球蛋白(gamma globulin)的马血清10ml，250mM EDTA 20ml，0.5％酚红1ml)，并且在4℃致敏10分钟。离心之后，每个V-型底96孔微板的孔中被加入100μl白细胞一表面抗原特异性单克隆抗体和1×10⁷/ml的50μl从血液分离的，提前在4℃超敏化30分钟的白细胞。进行二元染色，所用试剂与表4中的相同。采用第一清洗缓冲液清洗三次之后，剩余的白细胞用4℃的第二缓冲液清洗三次，该缓冲液与第一缓冲液基本相同除了马血清被去除，并混合了2％福尔马林溶液。多于2,000的染色细胞通过流式细胞术检查，数据分析通过CellQuest program(Becton Dickinson)的方式进行。

表4、用于免疫细胞检测中的单克隆吸附

标记(alpha beta)TCR/CD3 CD4/CD25 CD8a/CD25 (alpha beta) TCR/CD25 NK(CD49b)/C D28荧光FITC成对老鼠抗小鼠(alpha beta)TCR FITC成对老 鼠抗小鼠 CD4 FITC成对老 鼠抗小鼠 CD8a FITC成对仓鼠抗 小鼠(gamma delta) TCR FITC成对老鼠 抗小鼠 CD49b/PANNK荧光PE成对老鼠抗小鼠CD3 PE成对老鼠 抗小鼠CD25 PE成对老鼠 抗小鼠CD25 PE成对老鼠抗小 鼠CD25 PE成对仓鼠抗 小鼠CD28

结果和讨论

1)采用腹巨噬细胞检测吞噬作用

采用腹巨噬细胞检测吞噬作用的结果见图1。如图所示，腹巨噬细胞吞噬作用检测的结果被证实在采用路氏乳酸杆菌甘油溶液上清液和路氏乳酸杆菌+单核细胞增生李斯特菌溶菌产物(P＜0.05)处理的情况中最高。换句话说，路氏乳酸杆菌甘油溶液上清液无论是100μl或50μl处理具有相同的效果，并且几乎完全杀死被巨噬细胞所吞噬的单核细胞增生李斯特菌。每个400、200和100μl/ml的路氏乳酸杆菌+单核细胞增生李斯特菌溶菌产物的混合处理液部分杀死被巨噬细胞所吞噬的单核细胞增生李斯特菌。单独用路氏乳酸杆菌溶菌产物处理的小组比以上两个处理小组的吞噬活性要低并且单核细胞增生李斯特菌即使在被吞噬后仍然存活，虽然路氏乳酸杆菌溶菌产物处理小组(B)的吞噬细胞活性被看见高于单核细胞增生李斯特菌溶菌产物处理小组(C)(P＜0.05)。在这些结果的启发下，认识到路氏乳酸杆菌溶菌产物本身和它的代谢物能增强腹巨噬细胞的吞噬活性，特别是在病原菌溶菌产物存在的情况下，例如单核细胞增生李斯特菌。考虑到采用MRS培养基上清液处理的小组被发现不能增强腹巨噬细胞的吞噬活性；而采用甘油溶液上清液处理的小组显示高的吞噬活性，增强吞噬细胞活性的物质被假定为甘油代谢物同时也不能假定排除是具有高抗生素活性的无蛋白菌素的可能性。这件事被认为需要通过随后的试验进一步研究。

采用单核细胞增生李斯特菌溶菌产物处理的小组液被发现具有某种程度增强的吞噬活性，虽然它的活性低于路氏乳酸杆菌溶菌产物处理的小组。应该考虑到这个结果不是采用活着的单核细胞增生李斯特菌处理获得的结果，令人注意的特殊性在于吞噬活性被确认在采用高浓度单核细胞增生李斯特菌溶菌产物处理的小组中降低。这似乎表明巨噬细胞的活性被存在于高浓度的单核细胞增生李斯特菌溶菌产物中的几种毒性因子抑制。

2)淋巴细胞增殖检测

图2中所示的结果是采用从脾和胸腺分离的淋巴细胞进行的淋巴细胞增殖检测。从脾和胸腺分离的淋巴细胞的增殖在路氏乳酸杆菌上清液(甘油溶液)处理小组中被证实最高(P＜0.05)。

在实验中所采用的一种检测增殖的方法是阿尔玛蓝检测，其原理是由于细胞增殖而还原的试剂的程度。不能排除它的值可能由于醛氧化作用而高于试剂还原程度因为路氏乳酸杆菌上清液(甘油溶液)包含3HPA，一种醛。然而，因为路氏乳酸杆菌上清液(甘油溶液)处理小组的细胞增殖在显微观察下也被认定是最高的，路氏乳酸杆菌上清液(甘油溶液)的淋巴细胞增殖能力可以被证实。

仅仅采用路氏乳酸杆菌溶菌产物处理的小组也被确认具有某种程度的淋巴细胞增殖活性，虽然这种活性低于参照的刺激剂。

实施例3：给人类幼儿施用MCT油中的路氏乳酸杆菌以研究湿疹的减少

实施本研究以确定单纯的饮食补充路氏乳酸杆菌和MCT油是否可以影响目前进行标准治疗的幼儿特应性湿疹的治疗。伦德的儿童医院中研究的病例显示至少一个患有持续性湿疹，标准治疗不起作用的儿童通过30天的饮食补充路氏乳酸杆菌和MCT油而使湿疹题得以解决。本研究明确了采用路氏乳酸杆菌的标准治疗补充被证实在受控制的研究条件下具有这样的效果。

这项研究的主要终点是在12个月的治疗期间对于施用路氏乳酸杆菌和MCT油根据有效的评分系统(SCORAD)认定的湿疹程度和严重性的减少。治疗开始时对评分进行标准化。在治疗的3、6、9和/或12个月路氏乳酸杆菌-MCT小组的评分降低比安慰剂小组显著被认为是主要终点。

这是一项连续进行的双盲随机研究。诊断有中度特应性皮炎的并得到父母知情同意的年龄介于3个月至3岁之间(即快到但不包括4周岁生日的)的患者被包括在本研究中。诊断不需要是新的，例如已经在标准治疗下的儿童也可以被包括在内。

招募的患者来自看过敏病的患者人群。研究者向可能的参与者的父母提供有关研究的信息，如果满足纳入的标准，则获得书面同意，患者被包括进来。患者被随机分成两个组，每个组包含20名患者。一个小组接受在MCT油中的路氏乳酸杆菌补充品而另一组接受仅仅包含MCT油的安慰剂配方。研究的产品被服用12个月。

研究者基于患者的检查填写湿疹评分并且将湿疹拍照。根据调查表记录家庭环境以确定在家庭环境中的危险因素。研究产品被交给父母并开始日常的服用。

两组继续进行他们的湿疹常规药物治疗的处方。为了检测类固醇的使用，患者的父母被要求将所有他们的类固醇处方携带到医院并且药品被称重和记录。

患者的父母在接受研究产品后一个月接受电话访问以监控进程并且患者返回医院进行全面检查，湿疹的照片文件和更新的湿疹评分在3、6、9和12个月后完成。12个月完成治疗。

在研究开始取得血液样本以确定患者的总IgE水平和gm异型，并且在研究完成时再次确定总IgE水平。在两个时间点进行针对鸡蛋，牛奶，鱼，猫和花生的皮肤穿刺检测。

研究产品的容器被收回，称重并且记录以确保达到要求。剂量

在整个研究中，在MCT油中的路氏乳酸杆菌以1×10⁸CFU/天的剂量被施用，其相当于10滴路氏乳酸杆菌-MCT油。在安慰剂组中相等剂量的MCT油被施用。

药剂/干涉/饮食

所有形式的类固醇是允许的并且如果需要可进行特殊的饮食。患者在研究期间应该完全避免所有其它种类的添加了乳酸杆菌和益生菌的食物。

定义

湿疹严重性和程度的界定根据SCORAD指数(Kunz B，Oranje AP，Labreze L，Stalder J F，Ring J，Taieb A.Dermatology.1997；195(1)：10-9.Clinical validation and guidelines for the SCORAD index：consensusreport of the European Task Force on Atopic Dermatitis)。

每次就诊的程序

研究要求父母带着患者进行共计5次的临床检查和一次与一名父母的电话交流。

第一次就诊(0天)

书面同意之后，患者被包括在研究中。根据调查表记录患者的家庭环境以确定家庭环境中皮炎危险因素。研究者根据患者的检查结果填写湿疹评分，并且湿疹被拍照。对血液取样以分析总的IgE以及gm异型(变态反应的遗传决定簇)。进行皮肤穿刺试验以确定对鸡蛋、牛奶、鱼、花生和猫的过敏反应。

每名患者接受随机的数字并将相应的研究产品(两瓶)交给其父母开始日常的服用。所有的患者继续他们常规湿疹药物治疗的处方。

为了检测类固醇的使用，患者的父母被要求携带他们所有的处方类固醇到医院并且药品被称重和记录。

电话访问(1个月)

第一次就诊后的1个月后与患者的父母进行电话联系以监控进展，确保研究产品被服用并鉴别父母/患者在遵从研究协议中遇到的任何问题。

第二次就诊(3个月)

患者返回医院进行全面检查，对湿疹进行拍照记录并完成对湿疹评分表的更新。患者的父母被要求携带所有的处方类固醇到医院并且药品被称重和记录。首批的两瓶研究产品被称重并记录。一瓶应该是空的并且被研究者保留。另一瓶应该空了一部分并被保留在研究中继续使用。另外两瓶研究产品在本次就诊中被交给父母。

第三次就诊(6个月)

患者返回医院进行全面检查，对湿疹进行拍照记录并完成对湿疹评分表的更新。患者的父母被要求携带所有的处方类固醇到医院并且药品被称重和记录。研究产品的瓶子被称重并记录。两个瓶子现在应该空了并被研究者保留。第三瓶差不多是满的并被保留继续在研究中使用。在本次观察中另外两瓶研究产品被交给父母。

第四次就诊(9个月)

患者返回医院进行全面检查，对湿疹进行拍照记录并完成对湿疹评分表的更新。患者的父母被要求携带所有的处方类固醇到医院并且药品被称重和记录。研究产品的瓶子被称重和记录。一瓶应该是空的并被研究者保留。第二瓶应该空了一半而第三瓶是满的。这两瓶被保留继续用于研究中。

第五和最后一次就诊(12个月)

患者返回医院进行全面检查，对湿疹进行拍照记录并完成对湿疹评分表的更新。取出血液样本分析总IgE的量。进行皮肤穿刺试验以确定对鸡蛋，牛奶，鱼，花生和猫的过敏反应。

患者的父母应该携带所有的处方类固醇到医院并且药品被称重和记录。研究产品的瓶子被称重和记录。保留下来的两瓶现在应该是空的并被研究者保留。

统计方法和样本大小的确定

患者随机分成两组，每组包括25人。一般对于每个研究，基于前面的结果，确定治疗50％有效(如在较早的研究中)和80％有作用，估计每组有20就足以表现出效果。每组包括的另外5个孩子预备有中途退出的情况。

结果概述和讨论

表5、在0，3，6，9和12个月的湿疹评分路氏乳杆菌ATCC 55730+MCT油组

  Rand nr  0个月  3个月  6个月  9个月  12个月    2    58    0    16    37    36    6    34    6    0    0    0    7    48    6    4    0    4    10    35    7    0    8    7    11    34    7    0    0    4    12    30    2    1    1    4    15    50    14    8    12    10    17    28    11    4    10    11    19    26    0    0    0    0    21    28    10    20    13    4    23    23    10    8    4    8    25    26    4    4    4    4    27    31    13    27    18    10    29    44    19    17    14    13    30    56    18    38    18    18    31    44    4    19    11    10    35    48    14    14    7    20    36    28    6    4    4    4    39    44    4    0    0    0    40    35    4    0    4    4

平均值               37.50         7.95          9.20          8.25            8.55

MCT-油组

    1    41    40    18    29    20    3    38    11    16    15    17    4    28    22    12    12    39    5    34    18    4    12    12    8    19    14    21    10    18    9    68    68    60    51    60    13    54    48    29    26    48    14    26    60    42    42    48    16    56    8    64    48    31    18    54    30    48    31    54    20    12    12    4    12    13    22    22    0    0    0    0    24    30    10    31    48    34    26    34    13    22    11    18    28    56    4    7    10    11    32    39    32    30    28    18    33    28    31    22    22    31    34    31    48    31    42    34    37    35    31    22    22    12

平均值           37.65            26.50         25.70           24.45          27.30

路氏乳酸杆菌菌株ATCC 55730作为一种良好的3-HPA的产生菌与MCT油相结合对湿疹有很重要的改善。

实施例4：包含所选择菌株的产品的制备

在本实施例中，制备包含产生3-HPA的乳酸杆菌和MCT的产品。产品优选为包含路氏乳酸杆菌SD2112的油基组合物，具有良好的稳定性和保质期。

制备工艺的描述

在图5中显示了优选制备工艺的流程图。一个可用于在本发明中这样的可行工艺如下。

1、成分的混合

将中链三酸甘油酯例如Akomed R(Karlshamns AB5 Karshamn，Sweden)与二氧化硅，Cab-o-sil M5P，(M5P，Cabot)在一台BoIz混合器(Manufacturer Alfred BOLZ Apparatebau GmbH，Wangen im Allgau，Germany)中混合。

2、均质化

一台正弦泵和dispax粉碎机(Sine Pump，Arvada，Colorado，United States)被连接到BoIz混合器上并且混合物被均质化。

3、真空干燥

混合物在BoIz缸中在10mBar真空中被干燥12小时以去除油中的水分从而延长产品的保质期。

4、加入路氏乳酸杆菌

大约20kg干燥的油化合物被移到50升不锈钢容器中。路氏乳酸杆菌粉末，例如，冻干的细胞，以想要的数量被悬浮于油中。例如，加入0.2Kg活性为10¹¹CFU/g的培养物。它被缓慢混合直至均质化。

5、混合

与路氏乳酸杆菌的预混合物放回到BoIz混合器中。

6、出料

悬浮液被倒进一个200升玻璃容器中，并用氮气覆盖。悬浮液保存在容器中直至被装入产品瓶子中。

这里所配制的产品可用于口服。可替代的，配制用于管饲的产品可以添加本领域已知的肠营养品，或者用于皮肤局部应用的采用本领域公知的标准成分而使其适合于外用。

虽然这里已经介绍了特定的实施例，本领域技术人员很清楚可以作出各种修饰，这些均没有背离本发明的精神和范围。